私の研究室は、3次元および4次元の腫瘍モデリングを専門としています。腫瘍スフェロイドモデルは、生物学および創薬全体で広く使用されています。ただし、これらの実験からデータを収集するための既存のプロトコルは、高価で困難であり、制限されています。
このプロトコルは、簡単にアクセスできる化学物質と機器を必要とし、同様の結果を提供する現在の方法と比較して、それほど労働集約的ではありません。このプロトコルは、初心者にとって比較的簡単に実装でき、多くの手順が可逆的であるため、小さな間違いに対して堅牢になるように開発されました。ガラス瓶に0.5グラムの低融点アガロースを量ることから始めます。
そして25ミリリットルのPBSを加えます。蓋を閉めた状態で電子レンジで30〜60秒間溶液を沸騰させ、絶えず渦巻いてアガロースを溶かします。9グラムのN、N、N'N'テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン、22グラムの尿素、44グラムのスクロース、0.1グラムのトリトンX-100、および24.9グラムの脱イオン水を計量します。
絶えず混合しながら56°Cの水浴中で溶液を加熱する。結晶が溶解した後、溶液を室温で休ませて、混合中に形成された気泡を表面に上昇させます。テキスト原稿に記載されているアガロースオーバーレイ法を使用してスフェロイドを生成します。
メスを使用して1ミリリットルのピペットチップの先端を切り、オリフィスを拡大します。ピペットを使用して、ウェルからスフェロイドを吸引し、透明な1.5ミリリットルの円錐管に移します。同じ条件の複数のスフェロイドを同じチューブに組み合わせることができます。
スフェロイドを1ミリリットルのPBSで2回洗浄し、中性4%予温したパラホルムアルデヒド溶液を加え、摂氏37度でインキュベートします。20分後、パラホルムアルデヒド溶液を取り除き、スフェロイドを1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。次に染色のために、ピペットを使用して最大15個のスフェロイドを200マイクロリットルのPCRチューブに移します。
PBS中の0.5%Triton X-100を200マイクロリットル使用して細胞を透過処理します。PCRチューブを50ミリリットルのスクリューキャップチューブの中に入れ、チューブをアルミホイルで覆い、スフェロイドを室温で穏やかに攪拌しながらインキュベートします。2時間後、溶液を200マイクロリットルの抗体希釈バッファーと交換し、室温で一晩インキュベートします。
翌日、抗体希釈バッファーを除去してから75マイクロリットルの一次抗体を添加し、摂氏4度で2日半インキュベートします。インキュベーション後、上清を除去し、0.1%トゥイーンおよび0.1%トリトンX-100またはPBS-TTを含む200マイクロリットルのPBSでスフェロイドを2回洗浄します。その後、200マイクロリットルのPBS-TTと室温で4時間インキュベートします。
次に、PBS-TTを除去してから100マイクロリットルの二次抗体を添加し、摂氏4度で2日半インキュベートします。インキュベーション後、上清を除去し、PBS-TTで2回洗浄してから、200マイクロリットルのPBS-TTで4時間インキュベートします。取り付けには、200マイクロリットルのピペットを使用し、固定および染色したスフェロイドを500マイクロリットルのPCRチューブに、条件ごとに1本のチューブで移します。
溶液を200マイクロリットルの2%液体アガロースゲルと交換し、固定された最高速度で室温で30秒間、クイックスピンで遠心分離します。スフェロイドを50マイクロリットルの液体アガロースゲルに吸引し、24ウェルガラス底板のウェルに分注します。ゲルが硬化する前に、周囲のゲルのピペットチップを使用してスフェロイドを分離し、スフェロイドがゲルで覆われていることを確認します。
次に、ウェルあたり500マイクロリットルの透明化溶液を加えてゲルを沈め、室温で、暗所で、24時間インキュベートしてからイメージングします。イメージングの場合は、容器内の回転楕円体の取り付け高さを含め、回転楕円体全体を囲むのに十分な長さの作動距離を持つ対物レンズを選択します。赤道面を特定するには、XY平面で最大の表面積に達するまで焦点を調整し、必要なレーザー出力のパーセンテージ、検出器の電圧、ゲイン、およびオフセット設定で画像化します。
3次元画像の場合は、Z強度補正設定を使用して、回転楕円体の開始と終了を設定し、さまざまなZ深度で適切な信号強度を選択します。この研究は、PBSマウントスフェロイドと比較した、クリアされたFUCCIヒト黒色腫スフェロイドとクリアされていないFUCCIヒト黒色腫スフェロイドの比較を示しています。クリアソリューションは、サイズの歪みを最小限に抑えた鮮明な画像を提供します。
クリアリングソリューションはさらに、組織学的切片化なしで、スフェロイドのより深い細胞レベルの詳細の高解像度イメージングを可能にします。3次元共焦点画像を使用すると、200ミクロンの深さで細胞レベルの詳細を取得できます。さらに、ピモニダゾールとp27kip1について染色された凍結切開スフェロイドとクリアホールスフェロイドの比較が示されています。
ピモニダゾール染色はスフェロイドの低酸素領域を示し、p27kip1染色は、細胞周期停止およびDAPI核染色を示す。より深い浸透とより少ない散乱により、最小限の光損失で改善された3次元回転楕円体構造表現が可能になります。DRAQ7で染色されたFUCCIスフェロイドの3次元レンダリングを示します。
クリアリングソリューションは、スフェロイドサイズへの影響を最小限に抑えます。回転楕円体の直径は、回転楕円体と同じ断面積を有する球に基づいて定義した。スフェロイドは、2%〜6%の直径フォールド変化によって示されるように、最初の6時間でサイズがわずかに増加することが観察されました対照的に、24〜72時間後、スフェロイドはパラホルムアルデヒド固定後のPBSの対応するサイズとほぼ等しいサイズに戻りました。
イメージングの前に少なくとも24時間待って、透明化溶液をスフェロイドおよびゲルと平衡化させることが重要です。このプロトコルにより、開業医は多数のスフェロイドからデータを迅速に収集でき、生物学に関する詳細な洞察を提供する詳細な定量的数学的および統計的分析が可能になります。
