このプロトコルは、腫瘍モデルの進行に関する情報を非破壊的な方法で提供する。また、年齢一致サンプルに依存するのではなく、単一の凝集体内の薬物レジメン全体を通じて治療応答の指標を提供します。凝集体内の細胞密度と生存率を得るための従来の方法は、サンプルの固定と切片化を必要としますが、私たちの方法は非破壊的にデータを提供します。
そのため、時間の経過とともに 1 つの集計内で変更を追跡できます。この手法は、集合体の控えめな領域における薬物応答の理解を深め、これらのモデルがインビボ応答および薬物スクリーニング用途をどの程度反映しているかに示唆することが期待される。開始するために、標準条件下で所望の細胞株の70〜90%コンフルエント細胞培養物を調製する。
標準的なトリプシン処理法に従って細胞単層をそれらの培養フラスコから剥離し、細胞懸濁液を遠沈管に加える。10マイクロリットルの細胞懸濁液を血球計数器に加え、顕微鏡検査でカウントして懸濁液中の細胞数を決定する。ペレット細胞は遠心分離を経て、細胞を1ミリリットル当たり5番目の細胞に10倍から2.5倍の所望の濃度で培地に再懸濁した。
基底膜マトリックスで調製した懸濁液の場合、マトリックスバイアルをマイナス20°C保存から取り出し、冷蔵庫に入れて一晩解凍する。成長培地を入れた容器を準備し、10分間冷蔵して冷やします。凍結ピペットチップを用いて、この溶液の最終濃度が5%となるように冷却培地にマトリックスを加える丸底の各ウェルにこの培地を50マイクロリットル加え、非付着性96ウェルプレートに、これらのウェル中のマトリックスの最終濃度が2.5%以下の細胞懸濁液の添加後になるようにする。
マトリックスなしで調製した懸濁液の場合、50マイクロリットルの平らな成長培地を各ウェルに加える。50マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに分配する。播種直後にプレートを123Gで室温で10分間遠心分離し、各ウェルの底部に細胞ペレットが確実に集められるようにした。
構造イメージングにOCTシステムを利用する。高解像度の画像コレクションの場合は、スキャン レートを 5.5 キロヘルツに設定します。液体媒体中のサンプルの屈折率を 1.33 に設定します。
画面右側の画像パラメータウィンドウで、サンプルがこの関心領域内に収まるように、X、Y、Z の値を入力して視野を設定します。[3D取得モード]をクリックし、[記録]をクリックしてサンプルの3Dボリュームスキャンを収集します。ボリュームの再構築を作成するには、Imaris を開き、アリーナ内で変換された TIF ファイルに移動します。
編集に移動し、[画像のプロパティ]をクリックして、OCT画像のボクセルサイズを対応するXYZボックスに入力します。次に、[OK]をクリックします。オブジェクトツリーの上にある「新規サーフェスを追加」をクリックします。ツリーの下のメニューで、[自動作成をスキップ]をクリックして手動で編集します。
表示調整ウィンドウ内で、赤と黒の矢印を手動でスライドさせて、サンプルと背景のコントラストを高め、サンプルの視覚化を改善します。スライス位置をサンプルの一方の端のスライスに合わせます。エスケープキーを使用してマウスをナビゲーションモードから選択モードに変更し、[描画]をクリックします。
信号を表示している領域の輪郭を手動でトレースします。次の位置を入力ボックスに入力して、スライス位置を進めます。この次の位置は、前の位置よりもさらにサンプルに100スライス以下でなければなりません。
信号を表示している領域を手動でトレースします。サンプルの反対側の端に達するまで、サンプルの厚さを通してこのステップを繰り返します。次に、[サーフェスの作成]と左側のメニューをクリックして、これらのスライスをステッチします。
最後に、「編集」をクリックし、「マスク選択」をクリックしてから、「OK」をクリックしてボリュームの再構築を完了します。サンプルの総細胞密度を取得するには、[新しいスポットを追加]を選択します。アルゴリズム設定メニューで、すべてのボックスの選択を解除します。
青い矢印をクリックして、ソースチャンネル画面に移動します。表示されるドロップダウンメニューから、マスクされたチャンネルを選択します。サンプルの平均セル径をXY径ボックスに入力します。
バックグラウンド減算がチェックされていることを確認します。青い矢印をクリックして、分類スポットの画面に移動します。メニューの下部にあるグラフで、黄色のしきい値の左端をクリックしてグラフの左端にドラッグし、すべてのオブジェクトが黄色の影付きのしきい値に含まれるようにします。
次に、緑色の矢印をクリックしてスポットの作成を完了します。「統計」をクリックして識別されたオブジェクトの数を取得します。次に、「全体」をクリックし、最後に「スポットの総数」をクリックします。
作成したサーフェスをクリックし、[サーフェス スタイルの品質]タブに移動します。選択範囲を [中心点] に変更し、ピクセル幅を 20 未満に変更して、最適な視認性を実現します。[統計] に移動します。
次に、「詳細」をクリックしてから、「位置」をクリックして、中央のスポットの位置を記録します。オブジェクトツリーの上にあるメニューから「新規参照フレームを追加」を選択します。メニューの X、Y の横にある表示ボックスと固定ボックスをオンにします。
参照フレームアイコンの中心をクリックしてドラッグし、中央のスポットと一直線に揃えます。「XY 表示」ボックスと「修正」ボックスの選択を解除し、「XZ」用に選択します。もう一度、参照フレームアイコンの中心をクリックしてドラッグし、中央のスポットと一直線に揃えます。最後に、YZ 平面に対してこれを繰り返し、参照フレームが中心スポットと完全に揃うまで、これら 3 つの固定平面を交互に繰り返します。
オブジェクトツリー内の参照フレームをダブルクリックし、中央などの名前を変更します。作成したスポットをクリックし、[統計]に移動します。次に、「詳細」をクリックし、「参照フレームの位置」をクリックします。
位置X参照フレームをクリックして、最高値から最低値にソートします。最大値を記録して、集計の半径を取得します。手動計算を実行して、追加の対象場所を決定します。
これを行うには、X の中心値に 100 マイクロメートルを追加し、中心点の Y 値と Z 値を使用して、中心軸に沿った最初の位置を定義します。[新しいスポットを追加]を選択します。次に、「自動作成編集を手動でスキップ」を選択します。
キーボードのシフトボタンを押したまま、画面上の任意の場所をクリックして新しいスポットを配置します。対象となる最初の位置の XYZ 位置値を入力します。次に、「新規参照フレームを追加」を選択し、その位置に揃えます。
連続する各 X 位置に 100 マイクロメートルを追加します。最後の参照フレームをサンプルの外側の半径から50マイクロメートル未満離して配置します。作成したスポットをクリックし、[統計]に移動します。
メニューの右下隅にある[すべての統計をファイルにエクスポート]をクリックし、データをスプレッドシートに保存します。スプレッドシートを開きます。「原点からの距離」参照フレームタブに移動します。
mod 関数を使用して、対応する参照フレームに各距離を数値的に割り当てます。この列の値をフィルター処理して、各参照フレームの距離を操作します。参照フレームごとに、関数 COUNTIF を使用して、フレームから 50 マイクロメートル以内のオブジェクト数を計算します。
結果の値は、その地域のプラグ内のセルの数に対応します。この値を100マイクロメートルプラグの体積で割って、セル密度を求めます。スチューデントのT検定では、MDA-MB-231スフェロイドモデルの遷移層および外層よりも、回転楕円体コアの細胞密度が有意に高いことが明らかになった。
結果は、4日後にこの回転楕円体コアが圧縮されたことを示しています。AU565およびMDA-MB-231凝集体モデルの両方において、マトリックスの添加は体積または細胞数に影響を及ぼさないようであり、したがって細胞増殖に無視できる程度の影響しか及ぼさないようである。むしろ、マトリックス添加は、有意なコア圧縮を促進し、外層における細胞密度を低下させる細胞密度を再分配するように見える。
この新知見は、マトリックスがさまざまな乳がん細胞株における細胞凝集を可能にする物理的メカニズムに関する貴重な手掛かりとなる。次に、マトリックスで調製したAU565腫瘍スフェロイドを見て、成熟凝集体をトラスツズマブで処理し、局所細胞密度を5日間の薬物レジメンを通して評価した。プラグは、凝集体の厚さ全体にわたって100マイクロメートルごとにセットした。
細胞密度のわずかな変動は、最小の細胞死を示す各凝集体の内側500マイクロメートル内で経時的に観察された。主に腫瘍スフェロイドの外層における薬物応答の指標としての細胞死の可視化は、トラスツズマブの薬物浸透の問題と一致する。構造を犠牲にすることなく、凝集体の細胞生存率を非破壊的に測定できるようになりました。
これにより、単一の腫瘍凝集体における縦断的な薬物応答の評価が可能になり、候補抗がん剤の時間的および浸透性の性質が同定される。
