このプロトコルは、確立されたヒト疾患に似た腹部大動脈瘤のマウスモデルと、静脈内カテーテルによる反復治療を組み合わせたものです。動脈瘤の進行を阻止する臨床的必要性に対処するため。このプロトコルは、大動脈瘤の体積と形態の拡大に関する包括的な情報を含む、マウスの動脈瘤の進行を減らすための薬物をテストするための完全なワークフローを提供します。
プラス3D超音波。3D超音波は、味覚ベースのマウスモデルで動脈瘤が発生する腎下大動脈を測定するために適合させることができます。頸静脈カテーテル法は、静脈内注射を必要とする任意のセットに利用することができる。
12〜14週齢のAPOE欠損メールマウスを麻酔した後、背中の左上の小さな領域を剃り、肩甲骨の上に、10%ポビドンヨード溶液を塗布して剃毛領域を消毒します。背中上部の皮膚を1センチ横切開し、脊髄中央と左肩甲骨線の間にメスを入れます。鉗子で皮膚を持ち上げ、鈍い湾曲したはさみを使用します。
左後肢に向かって押して皮下ポケットを作ります。はさみを開き、開いたはさみをカットから引き出してポケットを広げます。ポンプをポケットにそっと挿入し、フローモデレーターを尾に向けて、切開部位から放出されるアンジオテンシン2の潜在的な干渉を最小限に抑えます。
次に、4.0吸収性の中断縫合糸で傷を閉じます。血管アクセスシステムを使用する。3つのフランス側を希望の長さに切断し、少なくとも3ミリメートルの重なりで血管アクセスシステムまたはVASの22ゲージの金属コネクタの上にカテーテルを押して、カテーテルを準備します。
ポートを保護するために、ボタンにアルミニウムキャップを置きます。麻酔をかけたマウスの腹側の首の右側と背中上部の右側から毛皮を剃ります。次に、ポビドンヨード溶液を塗布して、剃った部分を消毒します。
頸静脈の準備のために、右鎖骨の上に首の右側に0.5センチメートルの横方向の超鎖骨皮膚切開を行います。鈍い顕微手術用ピンセットを使用して、結合組織と脂肪を分離し、外頸静脈を露出させます。脂肪中の小さな血管を引き裂かないでください。
胸筋に近い5ミリメートルの血管を隔離します。次に、曲げたマイクロピンセットを使用して静脈の下の組織を鈍く解剖し、6.0シルク結紮糸のうち2〜3個を通過します。結紮糸を押し込み、生理食塩水をサイトに追加します。
ボタンを埋め込むには、マウスを裏返して腹臥位に置きます。ポビドンヨード溶液を塗布して、剃った部分を消毒します。背中上部に1センチの矢状切開を行い、脊髄中央線と右肩甲骨線の間にメスを入れます。
次に、鈍い湾曲したハサミを使用して、鈍い解剖によって切開部位の周りのVASのサイズよりわずかに大きい円形のポケットを作ります。鈍く湾曲したはさみを使用して、はさみをわずかに開いて、首の腹側切開に向かって右肩を頭蓋骨にトンネルします。次に、開いたはさみを引き抜き、さらに押し込まれるときにアクションを繰り返します。
トンネルが腹側切開部に到達したら、腹側から背側切開部への外科用クランプを通過します。カテーテルの3つのフレンチエンドをクランプに取り付け、カテーテルをトンネルに通して、腹側頸部切開から外れ、VASが背側切開部に配置されるようにします。次に、VAS外科用フェルト椎間板を背中の切開部に皮下挿入します。
ハンドリングツールのフォーク側を使用してカテーテルの開存性チェックを外し、保護アルミニウムキャップを取り外し、磁気端を使用してボタンを保持し、対応するインジェクターに取り付けられた1ミリリットルのシリンジで生理食塩水またはPBSを注入します液体が1つのフレンチエンドから漏れるまで。ポケットのボタンを尾側に押し、VASのフランジの下にあるVAのフェルトディスクの上で皮膚を2つの4つのOH中断された縫合糸で頭蓋で閉じます。静脈カテーテル法の場合は、マウスを仰臥位に戻し、切断面に生理食塩水を一滴加えます。
結紮糸を分離し、最初の結紮糸をカテーテルと頸静脈の周りにできるだけ頭蓋的に2〜3ノットで結び、静脈を結紮し、カテーテルを外側に固定します。2番目の結紮糸を胸筋のできるだけ近くに動かします。マイクロハサミを使用して斜めの角度を切り、カテーテルの3〜5ミリメートルが静脈に入るように鋭い端を作成します。
次に、生理食塩水で満たされた1ミリリットルの注射器に取り付けられた27ゲージの針を使用して、固定された頭蓋結紮糸を引っ張り、針を静脈と平行に押して、静脈に穴を開けます。次に、固定された頭蓋結紮糸を引っ張り、曲がったピンセットを使用してカテーテルを静脈にスライドさせることで、同様にカテーテルを静脈に挿入します。静脈と揃うまでカテーテルを押します。
2番目の結紮糸をカテーテル挿入領域に2〜3ノットで結び、血液漏れがないことを確認します。両方の結紮糸の余分な端をマイクロハサミで切り取り、生理食塩水を一滴加えます。次に、4.0吸収性の中断縫合糸で皮膚を閉じます。
前に示したように、マウスに所望の量の阻害剤またはPBS生理食塩水を注射します。シリンジをVASから外している間、プランジャーの正圧を維持します。回復後のマウスを監視します。
超音波ソフトウェアを使用して、30DBの画像深度のゲインを9.0ミリメートルに、幅を8.08ミリメートルに設定を調整します。次に、ステージ上の4つの心電図またはECG電極のそれぞれに電気ゲルを滴下し、マウスの四肢をそれらにテープで貼り付けます。温かい超音波ジェルをマウスの腹部に広げ、送信機を下げて腹部に接触させます。
大動脈を円形の高速脈動血管として識別します。左腎動脈の位置を特定し、頭蓋骨で最大12ミリメートルの領域を手動で調査して、関心のある領域に干渉がないことを確認します。左腎動脈に戻ります。
次に、プローブを動脈から頭蓋上に6ミリメートルに設定します。3D超音波取得の場合、呼吸同期を25%遅延、ウィンドウを50%に設定し、ECGトリガーを50ミリ秒に設定します。3Dオプションから、スキャン距離を11.96ミリメートルに設定し、ステップサイズは0.076ミリメートルに設定します。
157フレームを取得したら、画像を保存する前にスクロールして画質を確認します。2D直径取得の場合は、呼吸同期とECGトリガーをオフにし、超腎大動脈の12ミリメートルストレッチで最大の直径を持つ領域を手動で特定します。画面上でBモードを押して、Bモードの画像を取得します。
さらに、トランスデューサを動かさずにEKV画像の場合は、同じサイトでシステムの標準設定でEKV画像を取得します。超腎動脈瘤の発症と進行は、ベースライン8日目と27日目に超音波によってモニターされました。27日目の大動脈のトリクローム染色は、壁解離および壁内血栓を伴う形成された動脈瘤の形態を示す。
8日目の腹部大動脈瘤またはAAAの発生率および最初の9日以内の大動脈破裂の発生率は、マウスの9%がAAAを形成できなかったことを示した。しかし、マウスの35%がカテーテル移植前に大動脈破裂を経験したため、確立されたAAA疾患を有する残りのマウスの合計56%が治療群への層別化に最小限であった。PBS対照処置マウスにおいて、初期形成の速い動脈瘤と中程度の成長の動脈瘤の初期拡大とさらなる疾患進行との間に逆の関係が観察された。
例示的な超音波結果は、GSK 4 84処置がAAA進行を阻害する一方で、動脈瘤がマウスを拡大および制御し続けたことを明らかにした。静脈または血管アクセスボタンからのカテーテルの切断は、動脈瘤部位での未知の薬物濃度で皮下空間への薬物送達をもたらすため、カテーテル開存性が不可欠です。実験の最後にマウスを屠殺すると、水やその他の組織を組織学的に調査し、血液分析を実施して、標的の薬物効果のオンとオフを特徴付けることができます。
