El protocolo combina un modelo de ratón de aneurisma aórtico abdominal que se asemeja a la enfermedad humana establecida y el tratamiento repetitivo a través de catéter intravenoso. Abordar la necesidad clínica de bloquear la progresión del aneurisma. El protocolo proporciona un flujo de trabajo completo para probar medicamentos para reducir la progresión del aneurisma en ratones, incluida información completa sobre la expansión del volumen y la morfología del diámetro aórtico.
Además de ultrasonido 3D. La ecografía 3D se puede adaptar para medir la aorta infrarrenal donde se desarrollan los aneurismas en modelos de ratón menos basados en el gusto. El cateterismo de la vena yugular se puede utilizar para cualquier conjunto de inyecciones intravenosas que requieran.
Después de anestesiar a 12 a 14 semanas de edad con deficiencia de APOE ratón de correo afeitarse el área pequeña en el lado superior izquierdo de la espalda, sobre el omóplato, aplique una solución de povidona yodada al 10% para desinfectar el área afeitada. Haga una incisión transversal de un centímetro en la piel de la parte superior de la espalda con un bisturí entre la línea espinal media y la línea escapular izquierda. Sujetar la piel con fórceps y usar tijeras curvas romas.
Haga un bolsillo subcutáneo empujando hacia la extremidad posterior izquierda. Abra las tijeras y saque las tijeras abiertas del corte para ensanchar el bolsillo. Inserte suavemente la bomba en el bolsillo con el moderador de flujo hacia la cola para minimizar la posible interferencia de la angiotensina dos liberada por el sitio de la incisión.
Luego cierre la herida con suturas interrumpidas absorbibles 4.0. Utilizando el sistema de acceso vascular. Prepare el catéter cortando los tres lados franceses a la longitud deseada y empujando el catéter sobre el conector metálico de calibre 22 del sistema de acceso vascular o EVA con al menos tres milímetros de superposición.
Coloque la tapa de aluminio en el botón para proteger el puerto. Afeite el pelaje desde el lado derecho del cuello en el lado ventral y el lado derecho de la parte superior de la espalda de un ratón anestesiado. Luego aplique la solución de povidona yodada para desinfectar el área afeitada.
Para la preparación de la vena yugular, haga una incisión transversal de piel súper clavicular de 0,5 centímetros en el lado derecho del cuello sobre la clavícula derecha. Use pinzas microquirúrgicas romas para separar el tejido conectivo y la grasa que expone la vena yugular externa. Evite desgarrar pequeños vasos sanguíneos en la grasa.
Aísle cinco milímetros del vaso cerca de los músculos pectorales. Luego, diseccionar el tejido romo debajo de la vena usando micro pinzas dobladas y pasar a través de dos o tres de las ligaduras de seda 6.0. Meter las ligaduras y añadir una gota de solución salina al sitio.
Para la implantación del botón, voltee el mouse y colóquelo en posición prona. Aplique la solución de povidona yodada para desinfectar el área afeitada. Haga una incisión sagital de un centímetro en la parte superior de la espalda con un bisturí entre las líneas espinal media y escapular derecha.
Luego, use tijeras curvas romas para hacer un bolsillo circular ligeramente más grande que el tamaño del VAS alrededor del sitio de la incisión mediante disección roma. Use las tijeras curvas romas para hacer un túnel craneal sobre el hombro derecho hacia la incisión ventral en el cuello abriendo ligeramente las tijeras. Luego saca las tijeras abiertas y repite la acción a medida que se empuja más adentro.
Una vez que el túnel ha llegado a la incisión ventral, pase a través de pinzas quirúrgicas desde la incisión ventral hasta la incisión dorsal. Conecte tres extremos franceses del catéter a la pinza y tire del catéter a través del túnel para que quede fuera de la incisión ventral del cuello y el EVA esté en su lugar en la incisión dorsal. Luego inserte el disco de fieltro quirúrgico VAS por vía subcutánea en la incisión en la parte posterior.
Desenganche el catéter para verificar la permeabilidad usando el extremo de la horquilla de la herramienta de manipulación para quitar la tapa protectora de aluminio y use el extremo magnético para sostener el botón e inyecte solución salina o PBS con una jeringa de un mililitro conectada al inyector correspondiente hasta que el líquido se escape del extremo francés. Presione el botón caudalmente en el bolsillo y cierre la piel sobre el disco de fieltro de los VA debajo de la brida del VAS con dos suturas cuatro oh interrumpidas cranealmente. Para el cateterismo venoso, voltee el mouse hacia la posición supina y agregue una gota de solución salina al lado cortado.
Separe las ligaduras y ate la primera ligadura alrededor del catéter y la vena yugular con dos o tres nudos lo más cranealmente posible para ligar la vena y anclar el catéter al exterior. Mueva la segunda ligadura lo más cerca posible de los músculos pectorales. Usando micro tijeras cortar un ángulo diagonal para crear un extremo afilado de modo que de tres a cinco milímetros del catéter queden en la vena.
Luego perfore un agujero en la vena con una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro llena de solución salina tirando de la ligadura craneal asegurada y empujando la aguja paralela a la vena. Luego, inserte el catéter en la vena de la misma manera tirando de la ligadura craneal asegurada y deslizando el catéter en la vena con las pinzas dobladas. Empuje el catéter hasta que esté alineado con la vena.
Ate la segunda ligadura sobre la región insertada del catéter con dos o tres nudos y verifique que no haya fugas de sangre. Cortar el extremo sobrante de ambas ligaduras con micro tijeras y añadir una gota de solución salina. Luego cierre la piel con suturas interrumpidas absorbibles 4.0.
Inyecte al ratón con el volumen deseado de inhibidor o solución salina PBS como se demostró anteriormente. Mantenga la presión positiva sobre el émbolo mientras desconecta la jeringa del VAS. Monitorear a los ratones después de la recuperación.
Usando el software de ultrasonido ajuste la configuración para ganar una profundidad de imagen de 30 DB a 9.0 milímetros y ancho a 8.08 milímetros. A continuación, agregue una gota de electrogel a cada uno de los cuatro electrocardiogramas o electrodos de ECG en el escenario y pegue las extremidades del ratón a ellos. Extienda gel de ultrasonido caliente en el abdomen del ratón y baje el transmisor para ponerlo en contacto con el abdomen.
Identifique la aorta como un vaso circular de pulsación rápida. Localice la arteria renal izquierda y examine el área manualmente hasta 12 milímetros cranealmente para asegurarse de que no haya interferencias en el área de interés. Retorno a la arteria renal izquierda.
Luego coloque la sonda a seis milímetros cranealmente de la arteria. Para la adquisición de ultrasonido 3D, configure la puerta respiratoria con un retraso del 25% y una ventana del 50% y el disparador de ECG a 50 milisegundos. Desde las opciones 3D, establezca la distancia de escaneo en 11,96 milímetros con un tamaño de paso de 0,076 milímetros.
Después de adquirir 157 fotogramas, desplácese para verificar la calidad de la imagen antes de guardar la imagen. Para la adquisición de diámetro 2D, apague la activación respiratoria y el ECG y localice manualmente el área con el diámetro más grande en el tramo de 12 milímetros de la aorta suprarrenal. Presione el modo B en la pantalla y adquiera una imagen en modo B.
Además, para la imagen EKV sin mover el transductor, adquiera una imagen EKV con la configuración estándar del sistema en el mismo sitio. El desarrollo y la progresión de los aneurismas superrenales se monitorizaron mediante ecografía al inicio del día ocho y del día 27. Una tinción tricrómica de la aorta del día 27 ilustra la morfología del aneurisma formado con disección de pared y trombo intramural.
La tasa de incidencia de aneurisma aórtico abdominal o AAA en el octavo día y rupturas aórticas dentro de los primeros nueve días mostró que el 9% de los ratones no lograron formar un AAA. Sin embargo, el 35% de los ratones experimentaron roturas aórticas antes de la implantación del catéter, lo que resultó en un total del 56% de los ratones restantes con enfermedad AAA establecida que fue mínima a la estratificación en grupos de tratamiento. Se observó una relación inversa entre la expansión inicial y la progresión adicional de la enfermedad de los aneurismas de formación inicial rápida versus de crecimiento moderado en ratones tratados con PBS control.
Los resultados ejemplares de la ecografía revelaron que el tratamiento con GSK 4 84 inhibió la progresión de AAA mientras que los aneurismas continuaron agrandándose y controlando ratones. La permeabilidad del catéter es esencial ya que la desconexión del catéter de la vena o el botón de acceso vascular da como resultado la administración del fármaco en el espacio subcutáneo con concentraciones desconocidas del fármaco en el sitio del aneurisma. Cuando se sacrifican ratones al final del experimento, el agua y otros tejidos se pueden investigar histológicamente y realizar análisis de sangre para caracterizar los efectos de los fármacos dentro y fuera del objetivo.
