私のグループでは、発達中の新皮質の神経前駆細胞における遺伝子発現を制御するメカニズムに興味を持っています。特に、エピジェネティックなメカニズムに着目しています。これらは、神経前駆細胞が増殖して分化する可能性、つまり脳の適切な発達と機能にとって重要です。
皮質オルガノイドは、ヒトの脳の発達を研究することを可能にするエキサイティングな新しいモデルです。また、他の霊長類の発達をモデル化することもできます。このプロトコルでは、遺伝子機能を研究するためのヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーションについて説明します。
オルガノイドはビブラトームでスライスされるため、注射やエレクトロポレーションに特に適しています。ヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、遺伝子機能を研究するための強力な技術です。私たちは、この方法を用いて、脳の発達と進化に関与する霊長類発現成長因子EPIREGULINを研究しました。
また、この方法を使用して、さまざまな霊長類種のエンハンサー領域の活性を研究しました。まず、ヒト人工多能性幹細胞に由来するヒト皮質オルガノイドを3%低融点アガロースに埋め込みます。ビブラトームでオルガノイドを500マイクロメートルの厚さの切片にスライスします。
スライス後、120 rpmのオービタルシェーカー上で、4つの脳培地3を含む6ウェル超低アタッチメントプレートでオルガノイドの培養を続けます。次に、マイクロキャピラリープーラーを指定された設定に設定して、注射用のホウケイ酸ガラスキャピラリーを引っ張ります。引っ張った後、キャピラリーを大きなシャーレに保管し、テープで固定します。
エレクトロポレーションの日には、Tyrode溶液を摂氏37度に予温し、最終濃度24マイクロモルでCRISPR Cas9 RNPを調製します。pCAG-GFPプラスミドと0.1%Fast Green溶液を水で最終注入ミックスに加えます。心室のような構造が発達したヒト皮質オルガノイドを選択し、これらの構造を欠くオルガノイドは捨てます。
最大10個のオルガノイドを、タイロード溶液が入った6cmのシャーレに移します。マイクロローダーピペットチップを使用して、ガラスマイクロキャピラリーに10マイクロリットルの注入液を充填します。細い端をピンセットでつまんでキャピラリーを開きます。
注入混合物の一部をTyrodeの溶液に放出することにより、キャピラリーが開いているかどうかを確認します。.脳室様構造の中心に毛細血管を挿入し、マイクロインジェクターのフットスイッチを押して0.2〜0.5マイクロリットルの混合物を注入します。細い鉗子を使ってオルガノイドを押し、オルガノイドをつかまないように動きを制限します。
注入後、ワイドボアピペットチップを使用して、注入したオルガノイドを1〜2個、Tyrode溶液を含むエレクトロポレーションチャンバーに移します。注入したオルガノイドを電極に向け、頂端橈骨グリアと心室様領域が外側を向くようにします。オルガノイドの注入側を正極に向けて、ケーブルをエレクトロポレーションチャンバーに取り付けます。
エレクトロポレーターのパルスボタンを押すと、38ボルトのパルスが50ミリ秒ずつ1秒間隔で5回送られます。エレクトロポレーション後、ヒト皮質オルガノイドを4つの脳の培地である3つに戻し、24時間振とうせずに培養します。エレクトロポレーションされたヒト皮質オルガノイドを固定および凍結切片化した後、クエン酸緩衝液中で70°Cの水浴中で1時間抗原賦活化を行い、免疫組織化学分析を行います。
切片をPBSで5分間一度洗浄します。次に、スライドを短時間乾かし、ワックスペンを使用してセクションを丸で囲みます。0.1モルのグリシンをPBS中で使用して切片を室温で30分間急冷します。
次に、切片をPBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。ブロッキングバッファーを切片に添加し、室温で30分間インキュベートします。次に、切片を一次抗体で摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、切片をPBSで3回、それぞれ5分間洗います。切片を二次抗体およびDAPIとブロッキングバッファー中で室温で1時間インキュベートします。切片をPBSで洗浄した後、スライドを封入剤に封入し、蛍光顕微鏡で切片をイメージングします。
エレクトロポレーションオルガノイドの免疫組織化学により、エレクトロポレーション皮質オルガノイド内に複数の標的心室があり、オルガノイドの外側領域に位置する心室様構造を標的とする最適なエレクトロポレーションが明らかになりました。過剰な細胞死が観察された場合は、トラブルシューティングが必要です。これは、プラスミド濃度が高いか、エレクトロポレーション設定が最適でないことが原因である可能性があります。
オルガノイドの内部に面したエレクトロポレーションは、皮質板状の領域が隣接する心室と合流するため、解釈が困難になることがよくあります。過剰な注入量や強い電気パルスが加えられると、頂端面の破壊が起こり、心室破裂や細胞の層間剥離につながる可能性があります。ポリコーム抑制複合体1タンパク質PCGF4のノックアウトは、免疫組織化学によって確認され、GFP陽性細胞におけるシグナル強度の低下が示されました。
GFP陽性細胞のシグナル強度解析では、対照と比較して、ノックアウトサンプル中のPCGF4タンパク質レベルが有意に減少していることが明らかになりました。
