このプロトコルは、キャリアシステムが細胞とどのように相互作用するかに関する定量的データを提供します。定量的データは、エンジニアリングと最適化の鍵です。それは私たちが生物学的な質問からどれだけの質問に移ることを可能にします。
この手法は、定性的であった前臨床薬物キャリア性能の結果を定量的結果に変換するのに役立ちます。そして、これは、細胞を特徴付けるのとは異なるシステムでキャリアを特徴付ける場合でも機能します。ナノ側の直線的または定量的範囲内にある最適なキャリア希釈を見つけるには、数回の反復が必要になる場合があります。
適切な条件を見つけるために時間をかけてください。まず、フローセルをレーザーモジュールに取り付けます。1ミリリットルの蒸留水で毎秒0.1ミリリットルの割合でフローセルをゆっくりと洗い流します。
フローセル内に気泡が形成された場合は、懸濁液を部分的に引っ込めて気泡を気液界面に融合させてから先に進みます。次に、レーザーモジュール全体を機器内の所定の位置にロックします。フラッシュのほぼ半分でカメラを起動します。
キャリアの破片が洗い流されていることを必ず確認してください。[キャプチャ]を選択して[キャプチャ設定]タブを開き、[カメラの起動]をクリックします。1ミリリットルの空気でシステムを駆動します。
画面に静電気キャリアが表示されている場合は、製造元の指示に従ってフローセルを清掃します。キャリアが関与するキャリアシステムに応じて、超音波処理またはボルテックスを介してキャリアが十分に懸濁されていることを確認することにより、ナノ粒子追跡分析のためのキャリアを準備します。担体を水で希釈して、ミリリットルあたり1x10から7番目および1x10から9番目の担体の間のキャリア濃度で各サンプルの少なくとも0.6から1ミリリットルを調製する。
レーザーモジュールを取り出し、直立させます。最初のキャリアサンプルを1ミリリットルのシリンジに落とし、シリンジをチューブインレットに取り付けます。次に、サンプルをフローセルに慎重にロードします。
フローセル内に気泡が形成された場合は、懸濁液を部分的に引っ込めて気泡を気液界面に融合させてから進めてください。フローセル全体が液体で満たされていることを確認してから、ロードを一時停止します。必要に応じてカメラのフォーカスを調整して、個々のキャリアを視覚化します。
楽器の右側にある回転ノブで粗いフォーカス調整を行います。ハードウェアタブを選択して、より細かい調整を行います。フォーカススライダーを調整してフォーカスを変更します。
過飽和にならないようにするには、[キャプチャ]タブ内のスライダーを調整して最適なカメラレベルを選択します。機器にこのアクセサリが装備されている場合は、キャリアサンプルを含むシリンジをシリンジポンプに入れます。[SOP]タブで、[標準測定]を選択して、それぞれ30秒のキャプチャを5回行います。
ベースファイル名を入力し、必要に応じて、さまざまな選択肢を含むモーダルダイアログを開く詳細ボタンをクリックして、サンプル情報を追加します。スクリプトの作成と実行を押し、サンプルを進めるように求めるポップアップが表示されるのを待ちます。シリンジポンプを使用する場合は、[ハードウェア]タブを選択してから、[シリンジポンプ]タブを選択します。
希望の注入速度を設定し、注入を押します。シリンジポンプを使用しない場合は、サンプルを手動で進めます。ポップアップ ウィンドウで、[OK] を選択してキャプチャを開始します。
5 つのキャプチャのそれぞれが後、[高度なサンプルを指定してください] ポップアップが再表示されたら、サンプルがまだフロー セル内を移動していることを確認します。次に、 [OK] を選択して次のキャプチャを続行します。[プロセス] タブで、検出しきい値スライダーを 4 から 8 の間で調整して、画面に表示される個別のキャリアを正しく識別します。
視覚化を支援するために画面ゲインを調整できますが、下流の分析には影響しません。ポップアップで [OK] を押してトラッキング解析を開始します。単一の分析タブで分析をクリックして、分析の進行状況を監視します。
分析が終了したら、表示されるエクスポート設定プロンプトを探します。[PDF を含める] と [実験の概要を含める] が選択されていることを確認します。必要に応じて、他のエクスポート形式を選択します。
PDFデータエクスポートの結果セクションで、測定された濃度が信頼できることを確認するために、測定されたキャリア濃度がミリリットルあたり1x10から7番目、1x10から9番目のキャリアの間であることを確認し、濃度測定結果の下にエラーメッセージまたは注意メッセージがないか確認します。ストックから異なる希釈液を使用してこの手順を2回以上繰り返し、各サンプルの濃度が機器の直線範囲内にあることを確認します。テキスト原稿に記載されているように、ストックキャリア濃度を計算します。
テキスト原稿に記載されているように遊離または抗体結合蛍光色素溶液を調製する。式に示すように、濃度、分子量、アボガドロ数から原液の濃度を計算します。次いで、担体希釈液中で色素の段階希釈を行い、標準曲線サンプルを生成する。
次に、キャリアサンプルを測定プレートに追加し、マイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定します。テキスト原稿に記載されているように検量線を生成します。バルク蛍光をキャリア濃度で割ることにより、担体当たりの絶対蛍光強度を計算する。
関連するチャンネルで最適なPMT電圧設定を決定することにより、最終的なキャリア細胞実験用のフローサイトメーターをセットアップします。細胞をキャリアと一緒にインキュベートしていないネガティブコントロールサンプルを実行して、バックグラウンド蛍光を測定します。フローサイトメトリー定量ビーズを準備し、再懸濁します。
細胞サンプルに用いたのと同じバッファーを使用してください。ビーズ集団が別々に提供されている場合は、それらを一緒に引っ張ります。フローサイトメトリー定量ビーズおよびキャリア細胞サンプルを実行し、細胞当たりの蛍光強度を測定した。
フローサイトメーター定量ビーズを実行して検量線を生成し、絶対蛍光強度をMFIに変換します。これを使用して、テキスト原稿に記載されているキャリアの理論上のMFIを計算します。細胞キャリアサンプルを実行して、各サンプルの細胞あたりの蛍光強度を決定します。
最後に、測定されたサンプルの蛍光からバックグラウンド蛍光を差し引き、粒子あたりの蛍光で割ることにより、各サンプルの細胞あたりのキャリア数を計算します。633ナノメートルのポリメタクリル酸コアシェル粒子について、担体当たりの濃度および蛍光強度をサイトメーターストリームを用いて直接定量可能とした。対照的に、100ナノメートルの超常磁性酸化鉄ナノ粒子は小さすぎて個別に検出できず、バルクストリームを使用して分析されました。
標識定量ビーズを複数日使用して、フローサイトメーターで標準曲線を作成しました。測定されたMFIと定量ビーズのMESF値との間の相関は線形であり、測定日間でほぼ類似していた。蛍光標識されたHeLa細胞と235ナノメートルのポリメタクリル酸カプセルを用いた0時間から24時間の経時的実験では、時間の経過とともにMFIの増加が示され、カプセルがHeLa細胞と会合していることが示されました。
キャリアに対する明らかな細胞応答の違いは、相対的または絶対的な定量に依存して顕著でした。.絶対定量は標識強度とは無関係であり、したがってより比較可能であった。これらの手法は、粒子性能のより深い分析と比較の基礎となります。
これらの手法を使用して数学モデルをパラメータ化し、特定の実験とは無関係に粒子の性能を特徴付けることができることに興奮しています。
