Este protocolo fornece dados quantitativos sobre como os sistemas portadores interagem com as células. Dados quantitativos são fundamentais para engenharia e otimização. Permite-nos passar de questões biológicas sim ou não, para quantas perguntas.
Essa técnica é útil para converter resultados do desempenho pré-clínico do portador de medicamentos, que foram qualitativos, em resultados quantitativos. E isso funciona mesmo quando você caracteriza seu portador em um sistema diferente do que você caracteriza suas células. Pode levar algumas iterações para encontrar a diluição ideal do transportador que se enquadra nas faixas lineares ou quantitativas do lado nano.
Leve o seu tempo para encontrar as condições certas. Para começar, monte a célula de fluxo no módulo laser. Lave lentamente a célula de fluxo à taxa de 0,1 mililitro por segundo com um mililitro de água destilada.
Se as bolhas se formarem dentro da célula de fluxo, retraia parcialmente a suspensão para fundir a bolha com a interface ar-líquido antes de prosseguir. Em seguida, trave todo o módulo laser no lugar dentro do instrumento. Inicie a câmera aproximadamente na metade do caminho através da descarga.
Certifique-se de confirmar que os detritos da transportadora estão lavados. Selecione capturar para abrir a guia Configurações de captura e clique em Iniciar câmera. Acione o sistema com um mililitro de ar.
Se algum portador estático estiver visível na tela, limpe a célula de fluxo de acordo com as instruções do fabricante. Prepare os portadores para a análise de rastreamento de nanopartículas, garantindo que os portadores estejam bem suspensos via sonicação ou vórtice, dependendo do sistema de suporte envolvido. Diluir os transportadores em água para preparar pelo menos 0,6 a um mililitro de cada amostra com uma concentração de transportador entre 1x10 ao sétimo e 1x10 ao nono carretriz por mililitro.
Retire o módulo laser e coloque-o na posição vertical. Solte a primeira amostra transportadora numa seringa de um mililitro e prenda a seringa à entrada do tubo. Em seguida, carregue cuidadosamente a amostra na célula de fluxo.
Se as bolhas se formarem dentro da célula de fluxo, retraia a suspensão parcialmente para fundir a bolha com a interface ar-líquido antes de prosseguir. Certifique-se de que toda a célula de fluxo esteja cheia de líquido e, em seguida, pause o carregamento. Ajuste o foco da câmera, se necessário, para visualizar suportes individuais.
Faça ajustes grosseiros de foco com o botão rotativo no lado direito do instrumento. Faça ajustes mais finos selecionando a guia hardware. Altere o foco ajustando o controle deslizante de foco.
Para garantir que não haja saturação excessiva, selecione o nível de câmera ideal ajustando o controle deslizante na guia de captura. Se o instrumento estiver equipado com este acessório, carregue a seringa que contém a amostra transportadora na bomba da seringa. Na guia POP, selecione a medição padrão para fazer cinco capturas de 30 segundos cada.
Digite o nome do arquivo base e, se desejar, adicione informações de amostra adicionais clicando no botão avançado que abrirá uma diálogo modal com várias opções. Pressione criar e executar script e aguarde até que um pop-up apareça pedindo para adiantar a amostra. Se estiver a utilizar a bomba da seringa, selecione o separador hardware e, em seguida, o separador da bomba da seringa.
Defina a taxa de perfusão desejada e prima a perfusão. Se não estiver a utilizar a bomba da seringa, avance manualmente a amostra. Na janela pop-up, selecione OK para iniciar a captura.
Após cada uma das cinco capturas, quando o pop-up de amostra avançada reaparecer, verifique se a amostra ainda está se movendo pela célula de fluxo. Em seguida, selecione OK para prosseguir com a próxima captura. Na guia Processo, ajuste o controle deslizante de limite de detecção entre quatro e oito para identificar corretamente portadores distintos visíveis na tela.
Você pode ajustar o ganho da tela para ajudar a visualização, isso não afetará a análise a jusante. No pop-up, pressione OK para iniciar a análise de rastreamento. Monitore o progresso da análise clicando na análise em uma única guia de análise.
Quando a análise estiver concluída, procure um prompt de configurações de exportação para aparecer. Confirme se a opção incluir PDF e incluir resumo do experimento está selecionada. Selecione quaisquer outros formatos de exportação conforme desejado.
Na seção de resultados da exportação de dados em PDF, para garantir que a concentração medida seja confiável, verifique se a concentração do transportador medido está entre 1x10 para o sétimo e 1x10 para o nono portador por mililitro e verifique se há mensagens de erro ou mensagens de cautela abaixo do resultado da medição de concentração. Repetir o procedimento duas ou mais vezes com diluições diferentes da unidade populacional e assegurar que a concentração de cada amostra se situe dentro do intervalo linear do instrumento. Calcule a concentração de estoque de portadores conforme descrito no manuscrito do texto.
Preparar a solução de fluorocromo conjugada livre ou de anticorpos conforme descrito no manuscrito do texto. Calcular a concentração da solução-mãe a partir da concentração, do peso molecular e do número de Avogadro, conforme indicado na equação. Em seguida, execute uma diluição em série do corante no diluente transportador para gerar amostras de curva padrão.
Em seguida, adicione a amostra transportadora à placa de medição e meça a fluorescência usando um leitor de microplacas. Gere a curva padrão conforme descrito no manuscrito do texto. Calcular a intensidade absoluta de fluorescência por transportador dividindo a fluorescência a granel pela concentração do portador.
Configure o citômetro de fluxo para o experimento final da célula portadora determinando as configurações ideais de tensão PMT nos canais relevantes. Execute uma amostra de controle negativo onde as células não são incubadas com portadores para determinar a fluorescência de fundo. Preparar e ressuspender as esferas de quantificação da citometria de fluxo.
Use o mesmo buffer usado para as amostras de célula. Se as populações de contas forem fornecidas separadamente, junte-as. Execute o grânulo de quantificação da citometria de fluxo e as amostras de células transportadoras para determinar a intensidade de fluorescência por célula.
Execute os grânulos de quantificação do citômetro de fluxo para gerar uma curva padrão, convertendo a intensidade fluorescente absoluta em IFM. Use isso para calcular a IFM teórica dos portadores conforme descrito no manuscrito do texto. Execute as amostras portadoras de células para determinar a intensidade fluorescente por célula de cada amostra.
Finalmente, calcule o número de portadores por célula para cada amostra subtraindo a fluorescência de fundo da fluorescência medida da amostra e, em seguida, dividindo pela fluorescência por partícula. Para 633 nanômetros de partículas da casca do núcleo de ácido polimetacrílico, a concentração e a intensidade fluorescente por transportadora foram diretamente quantificáveis usando o fluxo do citômetro. Em contraste, as nanopartículas de óxido de ferro super paramagnético de 100 nanômetros eram muito pequenas para serem detectadas individualmente e foram analisadas usando o fluxo a granel.
As esferas de quantificação marcadas foram usadas em vários dias para gerar curvas padrão em um citômetro de fluxo. A correlação entre a IFM medida e o valor MESF das contas de quantificação foi linear e amplamente semelhante entre as datas medidas. Experimentos de curso de tempo usando células HeLa fluorescentes marcadas com cápsulas de ácido polimetacrílico de 235 nanômetros de zero a 24 horas mostraram um aumento na IFM ao longo do tempo, indicando que as cápsulas estavam se associando com células HeLa.
A diferença na resposta celular aparente aos portadores foi gritante, dependendo da quantificação relativa ou absoluta. A quantificação absoluta foi independente da intensidade da marcação e, portanto, mais comparável. Essas técnicas são a base para uma análise mais profunda e comparação do desempenho das partículas.
Estamos entusiasmados com o uso dessas técnicas para parametrizar modelos matemáticos que nos permitirão caracterizar o desempenho das partículas independentemente de qualquer experimento em particular.
