Bu protokol, taşıyıcı sistemlerin hücrelerle nasıl etkileşime girdiğine dair nicel veriler sağlar. Kantitatif veriler, mühendislik ve optimizasyon için anahtardır. Evet veya hayır biyolojik sorulardan, ne kadar soruya geçmemizi sağlar.
Bu teknik, kalitatif olan preklinik ilaç taşıyıcı performansından elde edilen sonuçları kantitatif sonuçlara dönüştürmek için yararlıdır. Ve bu, taşıyıcınızı hücrelerinizi karakterize ettiğinizden farklı bir sistemde karakterize ettiğinizde bile çalışır. Nano tarafın doğrusal veya kantitatif aralıklarına giren optimum taşıyıcı seyreltmesini bulmak için birkaç yineleme gerekebilir.
Doğru koşulları bulmak için zaman ayırın. Başlamak için, akış hücresini lazer modülüne monte edin. Akış hücresini saniyede 0,1 mililitre hızında bir mililitre damıtılmış su ile yavaşça yıkayın.
Akış hücresi içinde kabarcıklar oluşursa, devam etmeden önce kabarcığı hava-sıvı arayüzü ile birleştirmek için süspansiyonu kısmen geri çekin. Ardından tüm lazer modülünü cihazın içindeki yerine kilitleyin. Kamerayı kızarma işleminin yaklaşık yarısına kadar çalıştırın.
Taşıyıcı kalıntıların yıkandığını onayladığınızdan emin olun. Yakalama ayarları sekmesini açmak için yakala'yı seçin ve kamerayı başlat'ı tıklatın. Sistemi bir mililitre hava ile çalıştırın.
Ekranda herhangi bir statik taşıyıcı görünüyorsa, akış hücresini üreticinin talimatlarına göre temizleyin. İlgili taşıyıcı sisteme bağlı olarak, taşıyıcıların sonikasyon veya vorteks yoluyla iyi bir şekilde askıya alınmasını sağlayarak taşıyıcıları nanopartikül izleme analizi için hazırlayın. Her numunenin en az 0,6 ila bir mililitresini, mililitre başına 1x10 ila yedinci ve 1x10 ila dokuzuncu taşıyıcılar arasında bir taşıyıcı konsantrasyonu ile hazırlamak için taşıyıcıları suda seyreltin.
Lazer Modül'ü çıkarın ve dik olarak yerleştirin. İlk taşıyıcı numuneyi bir mililitrelik bir şırıngaya bırakın ve şırıngayı tüp girişine takın. Ardından numuneyi dikkatlice akış hücresine yükleyin.
Akış hücresi içinde kabarcıklar oluşursa, devam etmeden önce kabarcığı hava-sıvı arayüzü ile birleştirmek için süspansiyonu kısmen geri çekin. Tüm akış hücresinin sıvı ile dolu olduğundan emin olun, ardından yüklemeyi duraklatın. Tek tek taşıyıcıları görselleştirmek için gerekirse kamera odağını ayarlayın.
Cihazın sağ tarafındaki dönen düğme ile kaba odak ayarlamaları yapın. Donanım sekmesini seçerek daha ince ayarlamalar yapın. Netleme kaydırıcısını ayarlayarak odağı değiştirin.
Aşırı doygunluk olmadığından emin olmak için, yakalama sekmesindeki kaydırıcıyı ayarlayarak en uygun kamera düzeyini seçin. Cihaz bu aksesuarla donatılmışsa, taşıyıcı numuneyi içeren şırıngayı şırınga pompasına yükleyin. SÇP sekmesi altında, her biri 30 saniyelik beş yakalama yapmak için standart ölçümü seçin.
Temel dosya adını girin ve isterseniz, çeşitli seçeneklerle kalıcı bir diyalog açacak olan gelişmiş düğmeye tıklayarak ek örnek bilgileri ekleyin. Komut dosyası oluştur ve çalıştır'a basın ve lütfen örneği ilerletmenizi isteyen bir açılır pencerenin görünmesini bekleyin. Şırınga pompasını kullanıyorsanız, donanım sekmesini ve ardından şırınga pompası sekmesini seçin.
İstenilen infüzyon hızını ayarlayın ve demlemeye basın. Şırınga pompasını kullanmıyorsanız, numuneyi manuel olarak ilerletin. Açılır pencerede, yakalamaya başlamak için Tamam'ı seçin.
Beş yakalamanın her birinden sonra, lütfen gelişmiş örnek açılır penceresi yeniden göründüğünde, numunenin akış hücresinde hala hareket edip etmediğini kontrol edin. Ardından bir sonraki yakalamaya devam etmek için Tamam'ı seçin. İşlem sekmesinde, ekranda görünen farklı taşıyıcıları doğru şekilde tanımlamak için algılama eşiği kaydırıcısını dört ile sekiz arasında ayarlayın.
Ekran kazancını görselleştirmeye yardımcı olacak şekilde ayarlayabilirsiniz, bu aşağı akış analizini etkilemez. Açılır pencerede, izleme analizini başlatmak için Tamam'a basın. Tek analiz sekmesindeki analize tıklayarak analiz ilerlemesini izleyin.
Analiz tamamlandığında, dışa aktarma ayarları isteminin görünmesine bakın. PDF'yi dahil et ve deneme özetini dahil et'in seçili olduğunu onaylayın. İstediğiniz gibi diğer dışa aktarma biçimlerini seçin.
PDF veri dışa aktarımının sonuçlar bölümünde, ölçülen konsantrasyonun güvenilir olduğundan emin olmak için, ölçülen taşıyıcı konsantrasyonunun mililitre başına 1x10 ila yedinci ve 1x10 ila dokuzuncu taşıyıcılar arasında olduğunu doğrulayın ve konsantrasyon ölçüm sonucunun altında herhangi bir hata mesajı veya uyarı mesajı olup olmadığını kontrol edin. Prosedürü stoktan farklı seyreltmelerle iki veya daha fazla kez tekrarlayın ve her numunenin konsantrasyonunun cihazın doğrusal aralığına düştüğünden emin olun. Metin makalesinde açıklandığı gibi stok taşıyıcı konsantrasyonunu hesaplayın.
Serbest veya antikor konjuge florokrom çözeltisini metin yazısında açıklandığı şekilde hazırlayın. Stok çözeltisinin konsantrasyonunu, denklemde gösterildiği gibi konsantrasyondan, moleküler ağırlıktan ve Avogadro sayısından hesaplayın. Ardından, standart eğri numuneleri oluşturmak için taşıyıcı seyrelticideki boyanın seri seyreltilmesini gerçekleştirin.
Ardından taşıyıcı numuneyi ölçüm plakasına ekleyin ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak floresan ölçün. Metin makalesinde açıklandığı gibi standart eğriyi oluşturun. Toplu floresanı taşıyıcı konsantrasyonuna bölerek taşıyıcı başına mutlak floresan yoğunluğunu hesaplayın.
İlgili kanallarda optimal PMT voltaj ayarlarını belirleyerek son taşıyıcı hücre deneyi için akış sitometresini kurun. Arka plan floresansını belirlemek için hücrelerin taşıyıcılarla inkübe edilmediği negatif bir kontrol örneği çalıştırın. Akış sitometrisi kantitasyon boncuklarını hazırlayın ve yeniden askıya alın.
Hücre örnekleri için kullanılanla aynı arabelleği kullanın. Boncuk popülasyonları ayrı ayrı sağlanmışsa, bunları bir araya getirin. Hücre başına floresan yoğunluğunu belirlemek için akış sitometrisi kantitasyon boncuğu ve taşıyıcı hücre örneklerini çalıştırın.
Standart bir eğri oluşturmak için akış sitometresi nicelleştirme boncuklarını çalıştırın ve mutlak floresan yoğunluğunu MFI'ye dönüştürün. Metin makalesinde açıklandığı gibi taşıyıcıların teorik MFI'sini hesaplamak için bunu kullanın. Her numunenin hücre başına floresan yoğunluğunu belirlemek için hücre taşıyıcı numunelerini çalıştırın.
Son olarak, arka plan floresanını numunenin ölçülen floresansından çıkararak ve ardından parçacık başına floresana bölerek her numune için hücre başına taşıyıcı sayısını hesaplayın. 633 nanometre Polimetakrilik asit çekirdek kabuk parçacıkları için, taşıyıcı başına konsantrasyon ve floresan yoğunluğu, sitometre akışı kullanılarak doğrudan ölçülebilirdi. Buna karşılık, 100 nanometre süper paramanyetik demir oksit nanopartikülleri ayrı ayrı tespit edilemeyecek kadar küçüktü ve toplu akış kullanılarak analiz edildi.
Etiketli kantitasyon boncukları, bir akış sitometresinde standart eğriler oluşturmak için birkaç günde kullanıldı. Ölçülen MFI ile nicelik boncuklarının MESF değeri arasındaki korelasyon doğrusal ve ölçülen tarihler arasında geniş ölçüde benzerdi. Sıfırdan 24 saate kadar 235 nanometre polimetakrilik asit kapsülleri ile floresan etiketli HeLa hücrelerini kullanan zaman kursu deneyleri, kapsüllerin HeLa hücreleri ile ilişkili olduğunu gösteren MFI'da zamanla bir artış gösterdi.
Taşıyıcılara karşı görünür hücresel yanıttaki fark, göreceli veya mutlak nicelleştirmeye bağlı olarak keskindi. Mutlak niceleme, etiketleme yoğunluğundan bağımsızdı ve bu nedenle daha karşılaştırılabilirdi. Bu teknikler, partikül performansının daha derin analizi ve karşılaştırılması için temeldir.
Bu teknikleri, herhangi bir deneyden bağımsız olarak parçacık performansını karakterize etmemizi sağlayacak matematiksel modelleri parametreleştirmek için kullanmaktan heyecan duyuyoruz.
