この作品は、厚生助成金総合研究所＃1R01CA120825-01A1、マサチューセッツ大学アマースト校での共同医学研究（CBR）のプログラム、BhushanをJ. Toley用アイゼン奨学金によってサポートされていました。私たちは感謝してジェームズ·シェーファー、ビデオ撮影、ナレーター、そしてこのビデオの編集者の貴重な貢献を承諾します。

1。デバイス製造エラストマー材料のマイクロ流体の特徴のレプリケーションがダフィーらの方法に基づいていた。1 <ol><li>ミックスエラストマー（ポリジメチルシロキサン、PDMS）および9:1の重量比でシリコーンエラストマーキット（ ダウコーニング 、ミッドランド、ミシガン州）から硬化剤と4ミリメートル厚い層を形成するために、マスターの上に注ぐ。ドガは、5時間60℃で気泡を除去し、混合物を硬化させた。ピールエラストマー上の流れの特徴のスタンプを取得するための金型からPDMSを硬化させた。 </li><li> 1.5ミリメートル生検パンチ（Miltex、ヨーク、ペンシルバニア州）を用いて、入口と出口のためのパンチ穴はドリルプレスに搭載された。ごみを取り出し。 </li><li>スタンプの機能側と酸素プラズマエッチャーで8分間酸素プラズマにきれいなガラススライドを施す。それらの間の結合を形成するためにすぐに接触して処理された表面を持参してください。少なくとも5時間ウォーマースライド上60°Cでアセンブリを維持の結合を強化するために、S。 </li><li>有刺鉄線メスルアーロックコネクタ（Qosina、エッジウッド、ニューヨーク州）に取り付けられたオスルアーロックのインターフェースコネクタを使用して入口と出口に0.032 &quot;ID PTFEチューブ（ コールパーマー 、ヴァーノンヒルズ、イリノイ州）を接続します。 </li><li>シャットオフバルブとYコネクタ（;図1 アップチャーチ·サイエンティフィック 、オークハーバー、ワシントン州）を用いて、フロー· ​​アセンブリーを設定します。顕微鏡へのデバイスをマウントします。 20G 1.5 &quot;針（BDバイオサイエンス 、ロックビル、MD）を用いて、チューブに注射器を取り付けます。 </li></ol> 2。制服スフェロイドの形成スフェロイドはハンギングドロップ法2,3によって形成された。 <ol><li>無菌細胞培養フードの下で細胞をトリプシン処理。 </li><li> 5分間2000rpmでトリプシン処理した細胞を遠心し、6 mlの新鮮な培地中に再懸濁します。所望の最終濃度（表1）に原液を希釈します。 </li><li> 48ウェルプレートのカバーを取り外して、ステレオに逆さに置きrilizedフード。各ウェルに対応する円形領域は、表紙に明らかである。湿度を維持するために、滅菌水1mlでプレートの各ウェルを埋める。マイクロピペットを用いて、各円形領域における希薄な細胞溶液の20μl滴を入れてください。慎重にカバーを反転させ、滴が井戸の縁に手を触れないことを確実に、ウェルプレート上に置きます。 </li><li>指定した日数（表1）37℃でウェルプレートをインキュベートする。回転楕円体は、各ハンギングドロップで形成されます。 </li></ol> 3。デバイスにスフェロイドの導入このセクションの1、表、図2を参照してください。 <ol><li>流入口を介して導入を70％エタノールで洗浄して、デバイスを滅菌する。その後、PBSで洗浄し、細胞培養培地をHEPES緩衝続く。チューブに接続されている培地シリンジS Fのままにしておきます。 </li><li>注射器S Pに2から3スフェロイドを描き、気泡を除去するために注射器をタップし、装置のパッキングインレットに接続します。 </li><li>オープンインレットバルブV ピンと近いVのフィン 。オープン出口弁V Poutと近いV Fout を 。下向きの針で垂直パッキングシリンジを保持;スフェロイドが針のルアーロックコネクターにシリンジの底に沈むように見守る。パッキングシリンジにプランジャーを押し込み、スフェロイドがデバイスにチューブとフローを入力見守る。唯一のパッキング出口弁が開いているため、回転楕円体は、装置のチャンバーに入り、戻って（図2）で投稿することによって保持される。 </li><li>インレットバルブV ピンと出口弁V Pout を閉じます。シリンジポンプのシリンジS Fをマウントします 。オープンバルブV フィンとバルブV Foutを 。 3μL/ minでデバイスに流れ媒体。 </li></ol> 4。アポトーシス検出剤の紹介（CaspGLOW） スフェロイドとチャンバーを梱包した後に、uの平衡を許可検出アポトーシスまたは治療剤を導入する前に、栄養勾配および微小環境を確立するために、24時間に電話。チャンバ内の組織が上部と下部から入り込めない壁に接触しているので、組織の厚さに沿った栄養勾配（0.15ミリメートル）がありません。 24時間のインキュベーション後、組織の厚さに沿ってすべての細胞層は、したがって等価であり、唯一の異質性が離れて流路からの方向である。 <ol><li> Vのフィンをシャットオフし 、シリンジポンプを停止し、ポンプから注射器S Fを削除して、0.25μL/ CaspGLOW赤活性型カスパーゼ3マーカー（赤-DEVD-FMKのアンピシリンを含む培地を有するシリンジと交換し、 バイオビジョン 、マウンテンビュー、カリフォルニア州）。 </li><li>手動で古い媒体の変位を確実にするためにデバイスを介して、この溶液0.7mlのをフラッシュします。 、ポンプのシリンジをマウントする流れを再起動して、開いているVのフィン 。 5-8時間の期間にわたって、アポトーシスは、tに薬剤が拡散を検出彼は組織およびアポトーシスの地域で明るい蛍光を発する。この濃度でアポトーシスを検出したエージェントは、デバイスへのすべての後続フローソリューションで維持されます。 </li></ol>注意： <ol class="lroman"><li>組織の不均一性は、第6章で説明したように蛍光の直線強度プロファイルを取得することによって確認することができます。プロファイルには、組織は、細胞生存率に関して不均質であることが確認され、アポトーシスに空間的な勾配を示すべきである。 </li><li> CaspGLOWグリーン活性型カスパーゼ3マーカー（フルオレセイン-DEVD-FMK、バイオビジョン）もアポトーシスを検出するために用いることができる。このマーカーは、代わりに赤の蛍光色素ローダミンの緑色蛍光色素フルオレセインを含んでいます。 </li></ol> 5。治療薬の導入<ol><li>アポトーシス検出剤を含む、10μMのドキソルビシン塩酸塩（Sigma-Aldrich社、 セントルイス 、ミズーリ州のDox）を導入するための手順4.1から4.2の手順に従ってください。 </li><li> therapeの流れを継続する一定期間utic剤溶液。バルブV フィンを切り、シリンジポンプをオフにします。エージェントを検出し、アポトーシスを含む新鮮な培地の注射器を用いた治療用の注射器を交換してください。連続して顕微鏡下で組織を監視しながら、24 -36時間のための新鮮な媒体の流れを許可します。 </li></ol> 6。薬物拡散係数のタイムラプス顕微鏡と推定きれいな蛍光データを得るためには、組織の下層に顕微鏡の焦点を合わせることによって、すべての画像を取得する。垂直方向には栄養素勾配が（セクション4を見てください）​​が存在しないため、セルの底層は、上記のすべての他の層の良好な代表である。 <ol><li>全体の取得処理はIPLabでカスタマイズされたスクリプト（BD Bioscience社 、ロックビル、MD）を用いて、自動化されました。 10倍の倍率で満員スフェロイド30分毎（図3A）の透過光と蛍光画像を取得する。 Acquir前Doxの導入にバックグラウンド蛍光の電子画像。チャンバーの大サイズ（1000ミクロン×300ミクロン）に対処するために、隣接する二つの画像と一緒にタイル4を獲得。 </li><li>薬物の拡散係数の数学的な推定のために、最初のステップは、ImageJを使ってDoxの蛍光の平均線形強度プロファイルを生成することです。チャンバー内の組織を包含する関心の矩形領域（ROI）を選択します。流路からの距離の関数としての平均的な強度のプロファイルを生成するためにプロットprofileコマンドを使用します。最大3つの異なる時点のに対して、この手順を繰り返します。 </li><li>組織からの自家蛍光を測定するためにDoxを導入する前に、バックグラウンド蛍光画像を得る。得られた強度プロファイルから平均バックグラウンド蛍光強度を減算し、取得するために対応する最大強度で各プロファイルを正常化する<img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="C言語" /> （x、t）は （図3B）。 </li><li>次のステップでは、腫瘍組織内Doxの有効拡散係数Dを評価することである。 Doxの拡散は、以下の式（5）で表すことができる。 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="式（1）"/> ERFCは相補誤差関数であり、xはチャネルから組織への距離、tは Doxの導入（図3を参照）の後の時間です。と考え、各時点で、次の反復スキームを使用します。 <ul><li> Dの値を推測</li><li>各場所xでの式の右辺を計算する</li><li>両国間の二乗誤差（残差）の合計を計算する</li><li>残差を最小化するためにDを変更する</li></ul></li><li>平均組織中のDoxの平均実効拡散係数を推定するために、各時点で得られたDの最適値。 </li></ol> 7。代表的な結果： &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;マイクロ流体デバイスは、3次元の腫瘍組織の成長のために1ミリメートル×0.3 X 0.15ミリメートル光学的にアクセス可能な培養チャンバーを提供した。多細胞の腫瘍スフェロイドはこれらの室に流入していた、背面に2フィルタの投稿によって保持された。ハンギングドロップ法は、いくつかの細胞株からの一貫した大きさと形状のスフェロイドの迅速な形成を可能にした。最大3日間までスフェロイドが正常にデバイス上で増殖させた。チャンバ内の成長はスフェロイド内微小環境の再現性の修正と関連していた。アポトーシスは、流路の近傍の細胞が少なく、より高い組織に深く発生しました。デバイスは、腫瘍組織におけるドキソルビシンの拡散係数を推定するために使用されていました。 8.75×10 -7 cm 2 sで-1の得られた値は9.1の値と一致×10 -7 cm 2 sで-1はヒト乳癌に以前に6を報告した 。 <table border="1"><tbody><tr><td> 細胞株 </td><td> 必要な細胞濃度 </td><td> インキュベーション時間 </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300細胞/μL </td><td> 2-3日</td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750細胞/μL </td><td> 3-4日</td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150細胞/μL </td><td> 5-6日</td></tr></tbody></table> 表1。ドロップスフェロイドを吊るすためのパラメータ<table border="1"><tbody><tr><td> 一部 </td><td> 説明 </td></tr><tr><td> S F </td><td>フローシリンジ</td></tr><tr><td> S P </td><td>シリンジの包装</td></tr><tr><td> Vのフィン </td><td>フローインレットバルブ</td></tr><tr><td> V ピン </td><td>インレットバルブのパッキング</td></tr><tr><td> V Foutを </td><td>流れ出口バルブ</td></tr><tr><td> Vのふくれっ面 </td><td>出口バルブのパッキング</td></tr></tbody></table> 表2。フロー設定にシリンジとバルブ<img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="図1" /> 図1のフローセットアップV フィンとV Foutの回路図：フロー入口と出口弁、V ピンとV ふくれっ面 ：パッキング入口と出口弁、S FとS、P：フローおよびパッキングシリンジ。回転楕円体をチャンバ内に流入したときの梱包や包装シリンジ入口と出口弁が使用されています。フローシリンジと流入口及び出口弁は、その後培地を流すために使用されます。 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。デバイス上室に閉じ込められた回転楕円体の模式図。スフェロイドがデバイス上のチャンバ内に流入され、2つのフィルターposによってブロックされている室の奥のTS。 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。デバイス上の腫瘍組織内ドキソルビシン拡散。 A.は、ドキソルビシンの位置や濃度を（赤）を示す、組織の透過光および赤色蛍光画像を合併。スケールバーは250μmを表しています。ドキソルビシン蛍光からBに正規化された線形強度プロファイルは。

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特別な利害関係は宣言されません。

腫瘍内の血管系は、スパース行列で、病気7,8を開発しました 。血管系9にもかかわらず供給栄養素や薬にアクセスできない血管から遠い位置にある領域（&gt;100μm）にあります。得られた不均一微小環境は、多くの化学療法剤10の限られた有効性に貢献しています。ここで開発したマイクロ流体デバイスは、in vitroで、静止し、アポトーシスまたはネクローシス?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名称</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>注釈</th></tr><tr><td>シリコーンエラストマーキット</td><td>エルズワースの接着剤</td><td> 184シルELASTキット</td><td></td></tr><tr><td> Miltex生検パンチ</td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1.5ミリメートル</td></tr><tr><td> PTFEチューブ</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06417から31 </td><td> 0.032 &quot;ID </td></tr><tr><td>オス型ルアーロックコネクタ</td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td>とげの雌型ルアーロックコネクタ</td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td>遮断弁</td><td> IDEX健康科学</td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Yコネクタ</td><td> IDEX健康科学</td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1.5 &quot;針</td><td> BD Bioscienc電子</td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOWフルオレセイン</td><td>バイオビジョン</td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW赤</td><td>バイオビジョン</td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸ドキソルビシン</td><td>シグマ</td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td>ヒト結腸癌細胞株</td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td>人間の乳管癌細胞株</td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td>ヒト乳腺腺癌細胞株</td></tr></tbody></table>

microfluidic device for recreating a tumor microenvironment in vitro

我々は、in vitroでの異種3次元腫瘍組織への薬物の送達及び全身クリアランスを模倣したマイクロ流体デバイスを開発しました。血管系で配信栄養素は、実行可能な静止および壊死細胞の種類により構成される異種微小環境を生み出して、腫瘍のすべての部分に到達しない。多くの抗がん剤は効果的に細胞のため、この異質のすべてのタイプを貫通し、治療に失敗する。がん細胞の単層は、それが困難なin vitroモデルを適当に抗がん剤をテストすること、この異質性を模倣することはできません。当社のマイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィーを用いたPDMSから製造された。ハンギングドロップ法により形成された多細胞腫瘍スフェロイドは、挿入され、拘束装置の長方形のチャンバーに、片面に連続媒体の血流を維持した。デバイス上室の矩形形状は、組織内で線形グラデーションを作成しました。蛍光汚れは目を定量化するために使用された組織内のアポトーシスにおけるe変動。デバイス上の腫瘍が蛍光化学療法薬ドキソルビシンで処理した、タイムラプス顕微鏡組織への拡散を監視するために使用され、有効拡散係数を推定した。ハンギングドロップ法は、いくつかの癌細胞株からの均一なスフェロイドの迅速な形成を可能にした。デバイスは、最大3日間までスフェロイドの成長を可能にしました。媒体を流すの近傍の細胞がアポトーシスを起こしていた最低限、それらの遠い路からそれによって正確に血管に隣接する腫瘍内の領域を模倣し、より多くのアポトーシスであった。ドキソルビシンの拡散係数の推定値は、ヒト乳癌における以前に報告された値と一致していた。固形腫瘍における薬剤の浸透および保持は、その有効性に影響を与えるため、我々は、このデバイスは薬剤の挙動を理解し、新たながん治療薬を開発する上で重要なツールであると信じています。

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

私たちは、異種腫瘍微小環境を再現し、マイクロ流体デバイスの作製及び操作のための手順を紹介<em&gt; in vitroで</em&gt;。腫瘍組織内アポトーシスの変動を評価した蛍光染色し、腫瘍組織への化学療法薬ドキソルビシンの有効拡散係数を用いて定量した。

腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス<em&gt;体外で</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

11.5K ビュー.  University Of Massachusetts Amherst. 私たちは、異種腫瘍微小環境を再現し、マイクロ流体デバイスの作製及び操作のための手順を紹介 in vitroで。腫瘍組織内アポトーシスの変動を評価した蛍光染色し、腫瘍組織への化学療法薬ドキソルビシンの有効拡散係数を用いて定量した。

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A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

生物工学

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

マイクロスケールシュリーレン法によるマイクロ流体デバイス内の混合不均一性の分析

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

コンビナトリアルプラグ製造のためのマイクロ流体デバイスの構築

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

著者スポットライト:Precision Oncologyにおける計算アプローチと実験的アプローチの統合

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

コンビナトリアルプラグ製造のための二層マイクロ流体デバイス

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...