Il metodo può aiutare a rispondere alle domande relative alla sicurezza cardiaca preclinica e alla tossicità utilizzando dati reali basati sull'uomo per una transizione sicura di nuovi farmaci candidati alle fasi cliniche. Invece di utilizzare una serie di diverse tecniche in vitro e in vivo, il principale vantaggio di questo sistema ibrido è la valutazione simultanea dei cardiomiociti derivati da iPC, dei parametri elettrofisiologici e di vitalità umani e l'analisi delle proprietà contrattili in condizioni fisiologiche. Questo metodo può essere applicato per la scoperta di farmaci in quanto copre i cambiamenti elettrofisiologici, strutturali e contrattili dei cardiomiociti e un sistema a più alto rendimento che consente il test di 69 pozzetti contemporaneamente.
Per iniziare il rivestimento della piastra, lasciare il fondo della piastra di contrazione coperto dalla protezione della membrana fornita in aggiunta fino alla misurazione nel modulo di contrattilità. Per la semina dei cardiomiociti, preparare una soluzione di rivestimento in gel EHS diluita trasferendo 2,75 millilitri di gel EHS soluzione pronta all'uso e 8,25 millilitri di DPBS con calcio e magnesio in una provetta da centrifuga sterile. Quindi mescolare la soluzione.
Rimuovere la protezione della membrana dalla piastra di contrazione. Trasferire la soluzione di rivestimento preparata in un serbatoio di reagente sterile nel robot di automazione di laboratorio. Utilizzare il programma, aggiungere 100 microlitri con il robot di automazione di laboratorio e aggiungere 100 microlitri della soluzione di rivestimento per pozzetto.
Quindi riposizionare il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e incubare per tre ore a 37 gradi Celsius. Dopo aver scongelato e contato le celle, regolare le celle nel mezzo di placcatura raccomandato secondo le istruzioni del produttore della cella, ottenendo 11 volte 10 alla sesta cella per 11 millilitri per seminare un'intera piastra da 96 pozzetti. Utilizzare il programma per rimuovere 100 microlitri per rimuovere la soluzione di gel EHS dai pozzetti con il robot di automazione di laboratorio.
Successivamente, trasferire gli 11 millilitri di sospensione cellulare in un serbatoio di reagente sterile collocato nel robot di automazione di laboratorio e seminare le cellule con 100 microlitri di sospensione per pozzetto. Utilizzando il programma, le celle aggiungono 100 microlitri. Immediatamente dopo la semina cellulare, trasferire la piastra flessibile a 96 pozzetti nell'incubatore a umidità controllata a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, e lasciare che le cellule si depositino durante la notte.
Riscaldare 22 millilitri di terreno di mantenimento dei cardiomiociti da aggiungere a ciascuna piastra a 37 gradi Celsius in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Da 18 a 24 ore dopo aver seminato le piastre, trasferire il terreno fresco in un serbatoio di reagente sterile e lasciarlo accanto al robot di automazione di laboratorio. Quindi eseguire la rimozione media con il programma, rimuovere 100 microlitri.
Quindi posizionare il serbatoio del reagente contenente il mezzo fresco nel robot di automazione di laboratorio e erogare 200 microlitri del mezzo fresco per pozzetto con il programma, aggiungere 100 microlitri. Eseguire questo passaggio due volte per raggiungere 200 microlitri per pozzetto. Immediatamente dopo lo scambio del mezzo, trasferire la piastra nell'incubatore.
Eseguire uno scambio medio a giorni alterni fino all'aggiunta del composto. Da quattro a sei ore prima dell'aggiunta del composto, eseguire un cambiamento finale del mezzo trasferendo 22 millilitri di tampone di analisi fresco e caldo in un serbatoio di reagente sterile e lasciandolo accanto al robot di automazione di laboratorio. Immediatamente dopo lo scambio del mezzo trasferire nuovamente la piastra flessibile nell'incubatore.
Un'ora prima della misurazione di base trasferire la piastra al rispettivo dispositivo di misurazione. Nel software di controllo aprire Edit Protocol e selezionare la rispettiva modalità di misurazione, Flex Site o Impedenza EFP. Definire la durata o la lunghezza di una misurazione a 30 secondi e un intervallo di ripetizione a 10 minuti prima di salvare il numero di protocollo.
Quindi selezionare Avvia protocollo e continuare a compilare i campi richiesti. Quando i parametri sono impostati, selezionare Avvia misurazione. Eseguire un minimo di tre misurazioni di base a intervalli di cinque minuti poco prima dell'aggiunta del composto.
Rimuovere 50 microlitri del tampone di analisi da ciascun pozzetto senza rimuovere la piastra flessibile a 96 pozzetti dal dispositivo di misurazione, seguita dall'aggiunta di 50 microlitri della soluzione composta concentrata quattro volte in ciascun pozzetto della piastra secondo il piano di misurazione. Dopo l'aggiunta del composto, selezionare Aggiungi marcatore reagente per definire la disposizione della piastra composta e il volume della soluzione composta. Quindi selezionare Procedi con la misurazione standard o procedere con le serie di misurazioni in base al piano sperimentale.
L'analisi rappresentativa mostra gli effetti dell'inibitore della chinasi Erlotinib sulla contrattilità dei cardiomiociti umani derivati da iPSC. Alla concentrazione più bassa, Erlotinib ha indotto una diminuzione statisticamente insignificante dell'ampiezza, mentre le concentrazioni micromolari di Erlotinib hanno mostrato effetti cardiotossici tempo-dipendenti e dose-dipendenti. L'insorgenza dell'effetto è stata osservata a partire da 96 ore con un micromolare Erlotinib, mentre il trattamento con 10 micromolari Erlotinib ha determinato una diminuzione significativa 24 ore dopo l'aggiunta di composto.
Dopo l'applicazione di 10 micromolari di epirubicina, le cellule hanno cessato di battere entro 24 ore. Con l'applicazione di un'epirubicina micromolare, una drastica diminuzione dell'ampiezza dopo 24 ore è stata seguita dalla completa cessazione del battito fino a 48 ore. A 100 nanomolari, è stata osservata una diminuzione dipendente dal tempo dell'ampiezza del battito.
Alla concentrazione più bassa di 10 nanomolari, l'ampiezza fluttuava costantemente, confermando che l'effetto dell'epirubicina era solo dose-dipendente. Il trattamento con Doxorubicina e Nifedipina per 24 ore riduce la vitalità cellulare in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo. Dopo l'applicazione dell'aumento delle concentrazioni di Nifedipina, le registrazioni del potenziale di campo sulle cellule rivelano un accorciamento dipendente dalla concentrazione della durata del campo normalizzata.
La valutazione della nifedipina per quanto riguarda la contrattilità cardiaca ha anche mostrato una significativa diminuzione dell'ampiezza dipendente dalla concentrazione dopo la misurazione acuta con concentrazioni di 10 nanomolari e 13 nanomolari. È importante ricordare che le cellule sono generalmente sensibili ai parametri ambientali come le variazioni di temperatura e pH, nonché la simulazione meccanica che è particolarmente supportata sulle piastre di contrazione.
