El método puede ayudar a responder preguntas preclínicas relacionadas con la seguridad cardíaca y la toxicidad utilizando datos reales basados en humanos para una transición segura de nuevos candidatos a fármacos a etapas clínicas. En lugar de utilizar un conjunto de diferentes técnicas in vitro e in vivo, la principal ventaja de este sistema híbrido es la evaluación simultánea de cardiomiocitos derivados de iPC, parámetros electrofisiológicos y de viabilidad humanos, y el análisis de las propiedades contráctiles en condiciones fisiológicas. Este método se puede aplicar para el descubrimiento de fármacos, ya que cubre cambios electrofisiológicos, estructurales y contráctiles de cardiomiocitos y un sistema de mayor rendimiento que permite la prueba de 69 pocillos simultáneamente.
Para comenzar el recubrimiento de la placa, deje la parte inferior de la placa de contracción cubierta por el protector de membrana suministrado adicionalmente hasta la medición en el módulo de contractilidad. Para sembrar cardiomiocitos, prepare una solución diluida de recubrimiento de gel EHS transfiriendo 2,75 mililitros de solución de gel EHS lista para usar y 8,25 mililitros de DPBS con calcio y magnesio en un tubo de centrífuga estéril. Luego mezclar la solución.
Retire el protector de membrana de la placa de contracción. Transfiera la solución de recubrimiento preparada a un depósito de reactivo estéril en el robot de automatización de laboratorio. Use el programa, agregue 100 microlitros con el robot de automatización de laboratorio y agregue 100 microlitros de la solución de recubrimiento por pozo.
Luego vuelva a colocar la tapa en la placa de 96 pocillos e incube durante tres horas a 37 grados centígrados. Después de descongelar y contar las células, ajuste las celdas en el medio de recubrimiento recomendado de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la celda, lo que resulta en 11 veces 10 a la sexta celda por 11 mililitros para sembrar una placa completa de 96 pocillos. Utilice el programa de eliminación de 100 microlitros para eliminar la solución de gel EHS de los pozos con el robot de automatización de laboratorio.
A continuación, transfiera los 11 mililitros de suspensión celular a un depósito de reactivo estéril colocado en el robot de automatización de laboratorio y siembre las células con 100 microlitros de suspensión por pocillo. Usando el programa, las células agregan 100 microlitros. Inmediatamente después de la siembra celular, transfiera la placa flexible de 96 pocillos a la incubadora con control de humedad a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, y deje que las células se asienten durante la noche.
Calentar 22 mililitros de medio de mantenimiento de cardiomiocitos para agregar a cada placa a 37 grados centígrados en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. De 18 a 24 horas después de sembrar las placas, transfiera el medio fresco a un depósito de reactivo estéril y déjelo junto al robot de automatización de laboratorio. Luego realice la eliminación del medio con el programa, retire 100 microlitros.
A continuación, coloque el depósito de reactivo que contiene el medio fresco en el robot de automatización de laboratorio y dispense 200 microlitros del medio fresco por pocillo con el programa, agregue 100 microlitros. Realiza este paso dos veces para llegar a los 200 microlitros por pocillo. Inmediatamente después del intercambio medio, transfiera la placa a la incubadora.
Realice un intercambio medio cada dos días hasta la adición compuesta. De cuatro a seis horas antes de la adición del compuesto, realice un cambio final del medio transfiriendo 22 mililitros de tampón de ensayo fresco y caliente a un depósito de reactivo estéril y dejándolo al lado del robot de automatización de laboratorio. Inmediatamente después del intercambio medio, transfiera la placa flexible de nuevo a la incubadora.
Una hora antes de la medición de referencia, transfiera la placa al dispositivo de medición correspondiente. En el software de control, abra Editar protocolo y seleccione el modo de medición, el sitio flexible o la impedancia EFP respectivos. Defina la duración o longitud del barrido de una medida a 30 segundos y un intervalo de repetición a 10 minutos antes de guardar el número de protocolo.
A continuación, seleccione Iniciar protocolo y continúe rellenando los campos solicitados. Cuando se establezcan los parámetros, seleccione Iniciar medición. Realice un mínimo de tres mediciones de referencia en intervalos de cinco minutos poco antes de la adición del compuesto.
Retire 50 microlitros del tampón de ensayo de cada pocillo sin retirar la placa flexible de 96 pocillos del dispositivo de medición, seguido de la adición de 50 microlitros de la solución compuesta cuatro veces concentrada en cada pocillo de la placa de acuerdo con el plan de medición. Después de la adición compuesta, seleccione agregar marcador de reactivo para definir el diseño de la placa compuesta y el volumen de la solución compuesta. A continuación, seleccione Continuar con la medición estándar o continuar con la serie de mediciones de acuerdo con el plan experimental.
El análisis representativo muestra los efectos del inhibidor de quinasa Erlotinib sobre la contractilidad de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC. A la concentración más baja, Erlotinib indujo una disminución estadísticamente insignificante en la amplitud, mientras que las concentraciones micromolares de Erlotinib mostraron efectos cardiotóxicos dependientes del tiempo y la dosis. El inicio del efecto se observó a partir de las 96 horas con un Erlotinib micromolar, mientras que el tratamiento con 10 micromolares de Erlotinib dio lugar a una disminución significativa 24 horas después de la adición del compuesto.
Después de la aplicación de 10 micromolares de epirrubicina, las células dejaron de latir en 24 horas. Con la aplicación de una epirrubicina micromolar, una disminución drástica de la amplitud después de 24 horas fue seguida por el cese completo de la latido hasta las 48 horas. A 100 nanomolares, se observó una disminución dependiente del tiempo en la amplitud del latido.
En la concentración más baja de 10 nanomolares, la amplitud fluctuó constantemente, confirmando que el efecto de la epirubicina era sólo dependiente de la dosis. El tratamiento con doxorrubicina y nifedipina durante 24 horas reduce la viabilidad celular de forma dependiente de la concentración y el tiempo. Tras la aplicación de concentraciones crecientes de nifedipina, los registros de potencial de campo en las células revelan un acortamiento dependiente de la concentración de la duración del campo normalizado.
La evaluación de nifedipino con respecto a la contractilidad cardíaca también mostró una disminución significativa de la amplitud dependiente de la concentración en la medición aguda con concentraciones de 10 nanomolares y 13 nanomolares. Es importante recordar que las células son generalmente sensibles a los parámetros ambientales como los cambios de temperatura y pH, así como a la simulación mecánica que se apoya especialmente en las placas de contracción.
