このプロトコルは、アプタマーを初めて使用する研究者がプロジェクトでアプタマーを使用できるようにし、プロトコルを完了するために必要な個々の小さなステップを理解するのに役立ちます。アプタマーは非常に汎用性が高く、このプロトコルは、イムノフェノタイピングアッセイにおいてアプタマーがいかに簡単でシンプルであるかを示しています。アプタマーは、診断用途と治療用途の両方に使用できます。
このプロトコルは、それらの特異性と感度を確認するために行われる最初のステップです。この特定のアッセイは1つの細胞表面受容体の染色を示していますが、アプタマーはマルチパラメトリックフローサイトメトリーに非常に簡単に使用でき、表現型の高度な知識を提供します。アプタマーを使用する上で重要な側面は、使用前にアプタマーが正しく折り畳まれていること、およびバッファーとイオン強度の条件が選択されたときと同じであることを確認することです。
フラスコ内の培地を集めて廃棄した後、3ミリリットルのPBSを加えて細胞全体に広げます。各フラスコに1ミリリットルの0.25%のトリプシン-EDTAを加えた後、摂氏37度で5〜10分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞の剥離を視覚化します。次に、1ミリリットルの完全培地を細胞に加え、細胞を上下にピペットで動かして単一細胞懸濁液を作ります。
細胞を適切なチューブにピペットで入れ、200 Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞を1ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁し、一定量の細胞懸濁液をトリパンブルーで希釈することにより、トリパンブルー染色を使用して細胞をカウントします。血球計算盤とカバーガラスの間に約15マイクロリットルの混合物を分配して、細胞を数えます。
必要な数の細胞を収集し、テストサンプルごとに10万個の細胞があることを確認します。次に、細胞を摂氏37度で2時間インキュベートし、酵素剥離後の細胞膜上の目的のタンパク質の安定化を可能にします。2時間のインキュベーションの後、細胞を500 Gで5分間遠心分離します。
上清を廃棄した後、細胞を500マイクロリットルのブロッキングバッファーに再懸濁します。細胞を摂氏4度で30分間、断続的に混合しながらインキュベートします。この30分間のインキュベーションの間に、原稿に記載されているように2倍の濃度のアプタマーを調製することによりアプタマーフォールディングを行う。
次に、アプタマーを光から確実に保護しながら、必要な折り畳み条件に従ってサーモサイクラーマシンとアプタマーを混合してインキュベートします。30分間のインキュベーションの後、前に実証したように細胞を遠心分離し、上清を除去します。次に、1ミリリットルの洗浄バッファーを追加し、細胞を再度遠心分離します。
上清を除去した後、細胞を適切な容量の結合バッファーに再懸濁する。次に、再懸濁した細胞50マイクロリットルを氷冷96ウェルブラックプレートの各ウェルにピペットで入れる。次に、50マイクロリットルのアプタマーを50マイクロリットルの細胞にピペットで移し、混合し、摂氏4度の暗所で30分間インキュベートします。
遠心分離して上清を除去した後、ペレットを洗浄バッファーに注意深く再懸濁し、再び500Gで5分間遠心分離します。その後、洗浄ステップを2回繰り返しながら、フローサイトメトリー分析のために100マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。まず、フローサイトメーターの電源を入れ、次にコンピューターの電源を入れます。
次に、フローサイトメトリー分析ソフトウェアを開き、プログラムにログインし、サイトメータータブで流体の起動を実行します。新しい実験を作成するには、[実験] タブで [新しいフォルダー] をクリックし、フォルダーに "実験" という名前を適切に付けます。新しいフォルダをクリックして強調表示します。
次に、もう一度 [実験] タブで [新しい実験] をクリックし、実験に適切な名前を付けます。最初のサンプルスラッシュ標本を追加するには、実験タブで新しい標本をクリックし、標本に適切な名前を付けます。チューブサンプルを追加するには、検体をハイライト表示し、実験タブで新しいチューブをクリックします。
次に、適切な数のチューブと名前を追加します。必要なグラフを準備するには、ワークシートタブで新しいワークシートを開きます。新しいワークシートウィンドウが表示されたら、側方散乱と前方散乱のドットブロットグラフを準備して、目的の母集団を選択します。
前方散乱高さ対前方散乱領域のドットブロットグラフを準備して、単一細胞集団を選択します。次に、目的の蛍光色素に対するイベント数のヒストグラムを作製します。フローサイトメトリーを開始する前に、サンプル取得を制御するための取得ダッシュボード、電圧パラメータを調整するためのインスペクターとサイトメーター、およびすべてのグラフを含むワークシートが開いていることを確認してください。
まず、未処理の細胞を実行します。チューブを指す矢印が緑色であることを確認してください。この矢印が緑色でない場合は、矢印をクリックして緑色にします。
ピペットを使用して、各サンプルを96ウェルブラックプレートからフローサイトメトリーチューブに移します。集録ダッシュボードで、記録するイベントの適切な数を選択し、流量を低に変更して、[データの取得]をクリックします。FSCおよびSCCパラメータの電圧を調整し、細胞集団がドットプロット内で集中し、目的の細胞が失われないように、グラフのどちらの軸にも細胞が接触しないようにします。
前方散乱および側方散乱密度プロットで対象の母集団を特定して選択し、前方散乱信号が最も低い母集団を構成する破片を除外して、最初のゲートを定義します。ダブレット細胞は結果と結論に大きな影響を与えるため、ダブレット細胞集団を除外して2番目のゲートを定義します。取得速度を中または高に上げてサンプルをより速く分析しますが、毎秒200〜300イベントを超えないようにしてください。
次に、[データの記録] をクリックします。電圧を調整し、データをゲーティングして記録した後、サンプルを取り出し、[次のチューブ]をクリックします。次のサンプルを挿入し、すべてのコントロールサンプルとテストサンプルのデータの記録を繰り返します。
すべてのデータが収集されたら、50%漂白剤、FACSRinse、超純水の3本のチューブをそれぞれ高流量で5分間流して、フローサイトメーターを洗浄します。次に、サイトメーターのドロップダウンメニューから、[流路系シャットダウン]をクリックします。結果をfscファイルとしてUSBドライブにエクスポートして転送します。
[新規]ボタンを押して分析ソフトウェアを使用して分析し、分析を処理するための新しいドキュメントとウィンドウを作成し、サンプルファイルを新しいウィンドウにドラッグします。ダブルクリックして、染色されていないサンプルを開きます。単一細胞集団をゲートするには、P1集団を選択し、P1集団をダブルクリックしてFSCH対FSCAグラフを作成します。
ゲートされた単一セルをダブルクリックして、使用されている蛍光色素に対するイベントのヒストグラムを作成します。元のウィンドウでP1と単一セルを選択し、それらをすべてのサンプルにドラッグして、すべてのサンプルに同じゲーティングが含まれるようにします。次に、レイアウトエディターボタンをクリックしてレイアウトウィンドウを開き、2つのサンプルを互いにドラッグしてオーバーレイヒストグラムを作成します。
EpCAM陽性MDA-MB-231細胞において、TEPPおよびTENNで処理された細胞を表すヒストグラムを重ね合わせることは、TEPP処理された細胞が右にシフトしていることを示し、TENN処理された細胞と比較して、TEPPアプタマーの目的のタンパク質への結合が起こることを実証する。陰性対照において、TEPPおよびTENNのヒストグラムを重ね合わせたHEK 293T細胞は、EpCAM発現細胞においてTEPPがその受容体に結合したEpCAMアプタマーであることを示すいかなるシフトも反映しない。さらに、EpCAM陰性細胞では結合は観察されず、開発されたアプタマーの選択性と特異性が確認されました。
アプタマーが光から保護され、アプタマーと細胞がプレート上で混合され、フローサイトメーターに正しい電圧が設定されていることを確認します。これは、アプタマーの将来のアプリケーションに大きく依存します。たとえば、私たちはドラッグデリバリーに焦点を当てています。
したがって、次のステップは、蛍光顕微鏡を使用してアプタマーが内在化されているかどうかを評価することです。このプロトコルは、イムノフェノタイピングアッセイにおいて、アプタマーがモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を置き換えることがいかに簡単であるかを実証しています。
