このプロトコルでは、臨床サンプルまたは環境サンプルの感染性を通知できるセンシング分子を取得するために、感染性ウイルスと非感染性ウイルスを区別できるDNAアプタマーを選択する方法について説明します。この技術は、ウイルスの構造や配列に関する事前の知識を必要としないため、新興ウイルスを含む他の多くのウイルスの選択的アプタマーを取得するために適用できます。この技術により、感染性ウイルスの臨床診断および環境モニタリング用のアプタマーセンサーを開発し、誰かが伝染性であるかどうか、または環境消毒方法が意図したとおりに機能するかどうかを検出できます。
選択は、特にそれに不慣れな人にとっては難しいプロセスになる可能性があります。PCR条件を最適化し、qPCRで選択の進行状況を監視することが重要です。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるマルコス・グラマホです。
まず、最初の一本鎖またはSS-DNAライブラリーとプライマーを設計します。標準的な脱塩精製により、市販のソースからDNAオリゴを入手します。SS-DNAライブラリとプライマーを10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くエタノール沈殿で精製します。
次に、感染性および非感染性ウイルスの原液を入手するか、テキスト原稿に記載されているようにそれらを準備します。SS-DNAライブラリーの変性には、10マイクロリットルの100マイクロモルSS-DNAライブラリーを240マイクロリットルのSELEXバッファーと混合します。混合物を95°Cで乾浴中で15分間加熱し、次にチューブを氷の上に15分間置きます。
SELEXバッファー中の250マイクロリットルのSS-DNAライブラリを50マイクロリットルの感染性ウイルスと混合して、ポジティブセレクションを行います。室温で2時間インキュベートします。次に、400マイクロリットルの1ミリモルのT20配列を0.5ミリリットルのフィルターに加えて、非特異的部位をブロックします。
フィルターを30分間インキュベートします。フィルターを14, 000 Gで10分間遠心分離してT20溶液を除去します。次に、フィルターをSELEXバッファーで3回洗浄して、余分なT20シーケンスを除去します。
次に、SS-DNAライブラリ感染性ウイルス混合物をブロックされた100キロダルトンフィルターおよび遠心分離機に加えて、未結合配列を洗浄します。400マイクロリットルのSELEXバッファーを加えて遠心分離することにより、フィルターを3回洗浄します。フラクションをフィルターに保持し、フロースルーを廃棄します。
結合した配列を溶出するには、遠心分離フィルターの収集チューブを交換し、8モル尿素を含む300マイクロリットルのSELEXバッファーをフィルターに追加します。フィルターを摂氏95度で15分間加熱し、遠心分離して溶出した配列を含むフロースルーを収集します。完了したら、10%の漂白剤で材料を洗います。
次に、前のステップで収集したSS-DNA感染性ウイルス溶液をブロックされた10キロダルトンフィルターに加え、14, 000 Gで15分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。フィルターを300マイクロリットルのSELEXバッファーで3回洗浄し、遠心分離によって尿素を除去し、フロースルーを廃棄します。フィルター内の溶液を清潔な収集チューブで逆さまにして5分間遠心分離することにより、溶液を回収します。
ピペットを使用して回収された溶液の最終容量を測定し、Round 1Aサンプルとしてラベル付けします。最初のラウンドでラウンド1Aサンプルの90%をテンプレートとして取得し、最適化された条件を使用してPCRを実行します。ストレプトアビジン修飾磁気ビーズまたはMBを使用してSS-DNAを回収するには、製品を50マイクロリットルのアリコートに分割し、50マイクロリットルのMBを含むマイクロ遠心チューブに追加します。室温で穏やかな攪拌でチューブを30分間インキュベートします。
次に、チューブを磁気ラックに置き、MBを分離し、ピペッティングによって上清を除去します。200マイクロリットルの結合および洗浄バッファーをチューブに追加して、MBを2回洗浄します。次に、磁気ラックからチューブを取り外して軽くたたいてから、ピペッティングによってMBを均質な溶液に再懸濁します。
チューブを磁気ラックに再度置き、上清を取り除きます。2回目の洗浄後、MBを100マイクロリットルのSELEXバッファーに再懸濁し、溶液を摂氏95度で10分間加熱します。すぐにチューブを磁気ラックに入れ、SS-DNAプールを含む上清を収集します。
50マイクロリットルのSELEXバッファーを追加して、この回復手順を繰り返します。回収された画分の最終体積を測定し、Round 1Xとラベル付けします。SS-DNAプールを変性させるには、ラウンド1Xサンプルの60%を採取し、50マイクロリットルのSELEXバッファーと混合します。
サンプルをドライバスで加熱し、チューブを氷の上に15分間置きます。次に、SELEXバッファー中の変性SS-DNAプールを、カウンター選択ステップとして50マイクロリットルの水各ウイルスと混合し、室温で1時間インキュベートします。遠心分離フィルターで非特異的部位をブロックした後、ウイルス溶液でインキュベートした変性SS-DNAプールをブロックされた100キロダルトンフィルターに加えます。
フィルターを 14 , 000 G で 10 分間遠心分離し、フロースルーを収集します。300マイクロリットルの画分を取り、ミリリットルあたり1億コピーを含む50マイクロリットルの感染性ウイルスと混合する。室温で2時間インキュベートします。
本文に記載されているように、標準的なqPCRマスターミックスと精製SS-DNAライブラリの希釈液を調製します。qPCRを実行して、しきい値サイクルを決定します。実行後、標準曲線を使用して、ラウンド1Aおよびラウンド1XのSS-DNAの量を定量化します。
次に、結合DNA量を初期DNA量で割ったものとして溶出収率を計算し、溶出収率とラウンド数をプロットします。最後に、異なるラウンドの融解曲線をプロットします。ハイスループットシーケンシングの場合は、適切な市販キットを選択してください。
高、中、低のエンリッチメントを表す選択ラウンドの複数のプールと、プールごとにアダプターで異なるインデックスのペアを使用して最終的なプールを準備します。次に、準備した最終ライブラリをシーケンシング施設に送ります。シーケンシング解析のために、シーケンシング機能はシーケンシング機能によって逆多重化されています。
コマンドラインプログラムCutadaptを使用して、シーケンシングアダプターと選択プライマーを削除します。次に、FASTX-Toolkitプログラムを使用して、低品質のシーケンスを削除します。次に、逆方向ファイルに対してFASTX-Toolkit FASTX_reverse_補完機能を使用して、逆方向のシーケンスファイルと順方向のシーケンスファイルをマージします。
次に、組み込みのCATプログラムを使用して、ファイルを1つのファイルにマージします。FASTAptamer 解析ツールキットを使用して、異なる選択プールにわたる配列の濃縮を分析します。まず、FASTAptamer カウント関数と FASTAptamer クラスター関数を使用して、類似したシーケンスをクラスターにグループ化します。
次に、FASTAptamer エンリッチ関数を使用して、シーケンスとクラスターのエンリッチメントに関する情報を取得します。配列解析により得られた濃縮情報から候補アプタマー配列を同定する。複数のアプタマー配列を選択し、結合アッセイを用いて初期スクリーニングを行います。
この分析では、qPCRを使用して、感染性SARS-CoV-2特異的アプタマーのSELEXの進行状況を監視しました。溶出収率は、SELEXの各ラウンドで最初に増加し、ラウンド8と9で水平になりました。融解曲線を比較すると、77°Cから79°Cの高融解温度でのピークからのシフトが観察された。
また、最後の2ラウンドでは、低い融解温度でピークが観察された。連続した選択ラウンドで得られた配列決定されたSARS2 AR10の100万回あたりのリード数の相対存在量が示されています。SARS2 AR10の予測された構造は、ウイルスの認識に関与する可能性のあるステムループ領域を含む構造化された二次構造を示しました。
アプタマーが得られたら、別のタイプのセンサーである電気光学に組み込んで、ウイルス感染力を知らせることができるポータルおよび迅速なウイルス検出テストを開発できます。ウイルスの異なる変異体やステレオタイプに特異的なアプタマーが得られ、社会にとって最大の脅威となる変異株の迅速なモニタリングが可能になると考えています。
