この研究は、国立衛生研究所の国立アレルギー・感染症研究所が受賞番号K22AI134677の下で支援しました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).</li><li>Behnsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+dimensionality+controls+the+interaction+of+phagocytes+with+the+pathogenic+fungi+Aspergillus+fumigatus+and+Candida+albicans.">Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Infection:+From+Pathogenesis+to+Cell+Biology.">Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Rosowski, E. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+Small+Molecules+Enhance+Neutrophil+Activities+Against+Aspergillus+fumigatus+in+vivo+and+in+vitro.">Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro.</a> Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).</li><li>Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=zWEDGI:+Wounding+and+Entrapment+Device+for+Imaging+Live+Zebrafish+Larvae.">zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li><li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Live+Imaging+Device+for+Improved+Experimental+Manipulation+of+Zebrafish+Larvae.">Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).</li><li>Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Antifungal+Drug+Resistance.">Update on Antifungal Drug Resistance.</a> Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).</li></ol>

開示する紛争や財政的利益はありません。

ここで説明する感染モデルは、宿主の免疫応答、宿主病原体相互作用、および真菌病原体12、13、14、15を分析するために有益である。この情報は、蛍光標識病原体および宿主細胞13の高解像画像化、幼虫生存、およびCFU持続性を経て得ることができる。
マイクロインジェクション技術は、このプロトコルの成功に不可欠であり、異なるマイクロインジェクション装置およびセットアップを使用する場合に調整する必要があります。特に、射出の圧力と時間は2つの主要な変数であり、針によって排出される容積が〜3nLであることを確認するために調節することができる。鉗子でそれを切り取ることによって決定される針のサイズはまた注入される胞子の数を調節する;しかし、大きな開口部は、幼虫に組織損傷を引き起こす可能性があります。一方、開口部が小さすぎると、比較的大きな胞子(>2 μm)が外に出て、針詰まりを引き起こす可能性があります。この場合、針は、わずかに大きな開口部を持つようにクリップすることができます。
細菌のマイクロインジェクションのための他のプロトコルは、均質な注入混合物を維持するためにPVP-40を利用するが、我々は アスペルギルス 胞子とこのキャリアを使用する上で任意の利点を発見していない。針の詰まりは、真菌製剤を徹底的にボルテックスして、針をロードする前に塊を壊すことによって軽減することができます。時には、針の詰まりは、一時的に圧力または注射時間を増加させ、針が幼虫を取り巻く液体中にある間にマイクロインジェクターを引き起こすことによって取り除かれる。圧力と射出時間は、前のレベルに再び減少する必要があります。他のケースでは、詰まりを除去することができず、新しい針をロードし、再調整する必要があります。
このプロトコルは、幼虫あたり〜30~70個の胞子を注入するように設計されています。胞毛調製物の濃度と注入される体積に基づいて、この数はかなり低いことが知られている。しかし、これはこれらの条件下で注入された胞子の数であることを経験的に発見されています。なぜこの違いが起こったのかは不明ですが、針の胞毛が凝集している可能性があります。より多くの胞子を注入しようとする私たち自身の試みは、ほとんど失敗しています。
約30~70個の胞子が注入され、すべての幼虫を通して注射の一貫性を維持するために、幼虫を取り巻くE3に注入して胞子の数を確認してください。すべての注射を通して5〜6匹の幼虫ごとにこれを繰り返します。胞子数が変化すると思われる場合は、圧力および/または注入時間を調整して、複数の幼虫に一貫した数の胞子を注入することができます。しかし, 注意してください注射用量は、主に後脳に残り、中脳と前脳を埋めないことを.
局所感染を確実にするために、胞毛懸濁液は後脳心室内に含まれるべきです。これは、注射直後のフェノールレッド染色によって視覚化することができますが、赤い色は時間とともに拡散します。注射の場合、オティックベシクルの周りの領域を貫通し、45°~65°の角度で心室に到達します。この領域は、主要な血管を持っていない、より少ない組織の損傷を引き起こし、瞬時に治癒します。心室の皮膚が突き刺さると、 アスペルギルス 胞子注射に使用しなければならない針が細菌懸濁液よりも大きいため、胞子懸濁液が漏出する可能性があります。誤って注射または誤って損傷した幼虫は、黄身に数回注入して赤いマークを作成するか、または針で列から幼虫をドラッグすることによってマークすることができます。一連の注射が完了した後、これらの幼虫は、残りの部分がプレートから洗い流される前に除去され、処分されるべきである。メチレンブルーのないE3は、注射前に幼虫を麻酔し、注射後も幼虫を保つために使用されます。
注射時に、CFUカウントは感染した宿主内の生存可能な胞子の数を表す。しかし、胞子が催眠術に発芽する場合、これらは均質化中に別々の生存可能な「真菌単位」に分かれて、複数のコロニーを生じさせることができる。または、切れ目のない多細胞性催眠術は、単一のコロニーを生じさせ、真菌の負担の平均値を示すが不正確である。これは、CFUカウントと個々の幼虫の縦方向顕微鏡を組み合わせることで緩和することができ、注入された胞子の運命の視覚的データを提供する。
哺乳類系と比較して、ゼブラフィッシュ幼虫感染モデルは、その光学的なアクセシビリティのために特に重要である。自然免疫細胞の徴生と応答は、生きた無傷の宿主の中で視覚化することができる。これは、分子標的の遺伝的または化学的阻害と組み込まれ、各標的が生きている動物の アスペルギルス 胞子に対するマクロファージまたは好中球反応にどのように影響するかを分析することができる。
ゼブラフィッシュ幼虫アスペルギルス感染モデルは、IA12、13、14、15、16、17、18、19、20、22の異なる側面を記述するのに役立ち続けていますが、他の拡大領域があります。宿主側からは、細胞レベルの免疫応答を記述するために使用されますが、標的モルフォリーノ、CRISPR、安定した突然変異線、または化学的暴露と組み合わせることによって、分子レベルで免疫メカニズムを分析するために拡張することができます。1つの注意点は、すべての既知の哺乳類の自然免疫経路成分のホモログはゼブラフィッシュで同定されていないということです。
病原体側からは、異なる種および株の病原性が記載されている。将来の研究の有望な道は、特定の遺伝子またはタンパク質が毒性因子としてどのように寄与するかをテストするために変異ア スペルギルス 株を使用することです。それにより、新規抗真菌薬を開発して、これらのタンパク質を標的とすることができる。現在の抗真菌薬は、ヒト患者の有効性が低く、真菌28でこれらの薬剤に対する耐性が高まっている。このin vivoモデルは、これらの薬物が失敗した理由を調査するために使用することができ、新しい抗真菌薬の有効性をテストするための中間モデルとして使用することができます。全体として、このモデルを用いて発見された知見は、 アスペルギルス感染患者に対する効果的な治療法の将来の開発を促進することができる。

アスペルギルス・フミガトゥスは、ユビキタスな窒息菌であり、その空中胞子は屋内と屋外の両方で見つけることができます1.これらの胞子は、すべての人によって吸入されるが、免疫能力の個人1、2の肺から効果的にクリアされる。しかし、嚢胞性線維症などの肺の状態が変化した人は、肺の真菌発芽のために気管支肺アスペルギルス症を発症する可能性がある3。この感染の最も重篤な形態は、侵襲性アスペルギルス症(IA)、免疫不全の個体に影響を及ぼし、真菌を他の器官2,3に増殖することを伴う。IAは、抗真菌療法の利用可能性にもかかわらず、感染した患者の>50%の死亡につながる4.免疫能力のある個人では、自然免疫応答は吸入胞子1をクリアする上で大きな役割を果たす。しかし、この自然免疫クリアランスに寄与する特定のメカニズムは十分に理解されていない。IAの新しい治療法を見つけるためには、アスペルギルスのクリアランスにおける主要な自然免疫細胞(マクロファージおよび好中球)の細胞および分子メカニズムを理解することが重要です。
哺乳類モデルは真菌性毒性因子および宿主免疫応答の同定に役立っていますが、細胞レベルでの宿主と病原体の相互作用には視覚アクセシビリティが制限されています。組織培養実験では、動物全体に存在する複雑な多細胞環境と相互作用を完全に再現することはできません。したがって、ゼブラフィッシュは、このギャップを埋め、複数日感染8、9を越えて生きている無傷の宿主における宿主間相互作用の研究を容易にする代替モデル生物として人気を集めている。ゼブラフィッシュの自然免疫系は早くも24時間の受精後(hpf)10で発達し、適応体系は11を発症するのに4〜6週間かかり、自然免疫応答を単独で評価できる時間枠を提供する。自然免疫応答は、ヒトとゼブラフィッシュ11の間で十分に保存されている。ゼブラフィッシュは、光学的明瞭さ(無傷の宿主の高解像度のライブイメージングを可能にする)や遺伝的な難易度(分子機械学的研究を容易にする)など、これらの応答の調査を促進する多くの資質を有する。
ここで説明した幼虫ゼブラフィッシュアスペルギルス感染モデルは、もともとKnoxららによって開発されました。最近、我々のグループおよび他の人々によって、宿主免疫機構12、13、宿主病原体相互作用、免疫抑制13、16、17、真菌性毒性18、および抗真菌薬有効性19、20のメカニズムを調査するために拡大されている。このモデルは、ヒトアスペルギルス症の複数の側面を再現します。免疫担当の幼虫は耐性であるが、免疫不全の幼虫は感染に屈することができる12,13,16,17.
このモデルでは、幼虫の後脳心室に胞子を注入することにより局所感染が確立され、食細胞が少ない領域、および食細胞の採用と行動を評価することができる12、13。マクロファージは、ヒト1および哺乳類モデル6,21におけるアスペルギルス胞子に対する第一線の防御線として作用すると考えられている。同様に、ゼブラフィッシュモデルでは、マクロファージは、注入されたアスペルギルス胞子にリクルートされ、一方で好中球は、催眠成長12、13、22に応答して二次的に募集される。このモデルから、アスペルギルスは、感染の7日以上後に野生型免疫能力幼虫に持続できることも知られた。さらに、感染の全経過は、毎日の共焦点イメージングによって同じ生きた動物に続くことができる。
このプロトコルは、受精後2日間の後脳心室に胞子を注入する微小注入の技術を記述する(2dpf)幼虫。ゼブラフィッシュの幼虫は餌を与えずに最大10dpfまで生きることができるので、感染は最大7日間監視されます。免疫抑制は薬物治療によって誘発され得るが、幼虫への薬物の適用も記載されている。最後に、個々の幼虫からのCFUsの定量化および毎日のライブイメージング設定を含む、感染進行に従う2つの方法が記載される。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece reticle</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>RETR10</td>
			<td>For calibrating needles, used in Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector setup: Back pressure unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Footswitch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FTSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipet holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>M-Pip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator setup: Micromanipulator</td>
			<td>Narashige (Tritech)</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand and plate</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>To homogenize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6380706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ65855-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L spreaders</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14 665 230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary needles (no filament)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>TW100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-310</td>
			<td>To load the needle with Aspergillus suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM475855-1R</td>
			<td>To filter Aspergillus suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAL0669009</td>
			<td>To prevent pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 1% solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>57254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC118000500</td>
			<td>To anesthetize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Solutions</td>
			<td>Components/Recipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 media: 60x E3</td>
			<td>17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 &#183; 7H2O, to 1 L with H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x E3</td>
			<td>16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine stock solution</td>
			<td>2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 &#183; 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar</td>
			<td>10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Nitrate salts</td>
			<td>120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 &#183; 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace elements (TE)</td>
			<td>2.20 g ZnSO4 &#183; 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 &#183; 4H2O, 0.16 g FeSO4 &#183; 7H2O, 0.16 g CoCl2 &#183; 6H2O, 0.16 g CuSO4 &#183; 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 &#183; 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infection of zebrafish larvae with aspergillus spores for analysis of host-pathogen interactions

侵襲性アスペルギルス症(IA)は、免疫不全の個人の間で最も一般的な真菌感染症の1つです。抗真菌薬が利用できるにもかかわらず、IAは感染した免疫不全患者において>50%の死亡率を引き起こす可能性がある。新しい治療法を開発するためには、感染感受性と感染患者の低生存率に寄与する宿主および病原体因子の両方を決定することが重要です。生来の免疫応答は 、アスペルギルス 胞子の認識とクリアランスにおいて極めて重要な役割を果たしますが、正確な細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていません。信頼できるモデルは宿主と病原体の間の詳細な機械相互作用を調査するために必要である。ゼブラフィッシュの幼虫の光学的明瞭さと遺伝的な難解さは、生きている無傷の宿主における複数のヒト細菌および真菌感染症の宿主病原体相互作用を研究する興味深いモデルとなる。このプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュ アスペルギルス 感染モデルを記述する。まず、 アスペルギルス 胞子を単離し、マイクロインジェクションを介してゼブラフィッシュ後脳心室に注入する。次いで、免疫抑制薬などの化学阻害剤を幼虫水に直接添加する。注射された幼虫における感染を監視する2つの方法が記載されており、コロニー形成ユニット(CFU)列挙体および2)繰り返し、毎日のライブイメージングセットアップのための幼虫の均質化を含む。全体的に、これらの技術は、生体内で のアスペルギルス 感染の進行を機械論的に分析するために使用することができ、宿主と病原体の相互作用を尋問するために異なる宿主の背景および アスペルギルス 株に適用することができる。

アスペルギルス胞子をゼブラフィッシュ幼虫の後脳に微小注射した後、感染結果は生存、CFUs、ライブイメージングを含む複数のアッセイを続けることができます。生存アッセイでは、1~7dpiで生き残った感染した幼虫の数を監視した。野生型の幼虫を治療せずに放置すると、死はほとんど見られず、幼虫の約80~100%が実験全体を生き延びていた(図1)。幼虫が免疫抑制された場合、例えばコルチコステロイド薬デキサメタゾン(10μM)への曝露により、有意に減少した生存率が観察された(図1)。
CfUsをA.フミガトゥス胞子に感染した野生型幼虫からの7日間の実験を通して定量化した場合、胞子の持続性が観察され、時間の経過とともにクリアランスが遅かった(図2A)。1、2、3、5、および7 dpiで生存する胞子の数を、0 dpiで注入された胞子の数に正規化して、反復間の持続性とクリアランスを比較した(図2B)。
白血球中の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック魚株は、蛍光タンパク質発現 アスペルギルス 胞子と共に、白血球の形成および行動、ならびに真菌発芽および発育13の両方を可視化するために使用することができる。マクロファージに標識を付けた場合(例えば、Tg(mpeg1:H2B-GFP))、幼虫の50%程度のマクロファージクラスタリングが一般的に観察され、2~3dpiから始まる(図3A)。好中球(Tg(lyz:BFP))の採用は、典型的には遅延し、主に真菌発芽が起こった後に起こる(図3A)。幼虫の大部分の実験全体に対して真菌の負担が持続する一方で(図3A)、クリアランスが観察された(図3B)。一部の幼虫では、後に感染で後に後に、マクロファージで真菌の播種のために真菌の負担が観察された。
オティックベシクル周辺は、この普及が見つかる可能性のある場所の1つです(図3C)。これらの観測は、実験全体の過程で複数の個々の幼虫で定量化された(図4)。典型的には、発芽は5dpiによって幼虫の60%〜60%で見られた(図4A)。食細胞クラスター領域、マクロファージの採用、および好中球の採用は、時間の経過と共に変化し、幼虫全体で変化し、実験を通じていくつかの傾向があり、時間の経過とともに解決します(図4B,C,D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig01.jpg"> 図1:感染した幼虫の代表的な生存率分析アスペルギルス感染幼虫は、車両制御(DMSO)またはデキサメタゾン(Dex)にさらされ、生存を監視した。データは、3 つのプールされたレプリケートを表します。平均注入CFUs:DMSO = 30、Dex = 29(p値およびハザード比は、Cox比例ハザード回帰分析、****p<0.0001)によって計算された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2.jpg"> 図2:代表的なCFUは、注射直後(0dpi)および感染経過時(2、3、5、および7 dpi)の感染幼虫から数える。感染した幼虫8匹を均質化し、各時点でCFUを数え、複製するためにメッキした。(A) 1 つのレプリケートからのデータの例。各点は1つの幼虫を表し、棒は各時間ポイントの平均を表す。(B) CFU カウントは、レプリケートごとに 0 dpi の CFU カウントに正規化され、3 つのレプリケートがプールされました。分散分析を用いて実験条件間でデータを比較し、推定限界平均と標準誤差の観点から要約した。Asterix は、0 dpi の CFU と比較して統計的有意性を表します (*p < 0.05、**p < 0.01、****p < 0.0001)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2.jpg"> 図3:感染実験からの代表的な画像。蛍光マクロファージを有するPTU処理幼虫(mpeg1:H2B-GFP)および好中球(lyz:BFP)をRFP発現 A.フミガトゥスを注射した。共焦点顕微鏡上で2、3、および5dpiで、生きた、感染した幼虫を繰り返し画像化した。最大強度 Z 投影イメージが表示されます。幼虫の模式図は、各パネルのイメージングの位置を示しています。全てのスケールバーは100μmを表し、25μmのスケールバーを除き(A)画像は2、3、5 dpiで撮影された単一の幼虫から、典型的な感染進行を表します。インセットは3日目と5日目に真菌発芽を示す。(B) 感染をクリアできる幼虫のサブセットの代表的な画像であり、真菌の負担が低く、5 dpiではあまり炎症を起こさない。(C) 後の時点で感染が後脳から広がる幼虫のサブセットの代表的な画像。この画像では、真菌、マクロファージ、好中球は、オチクジクのベシクルの周りと下に見つけることができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2.jpg"> 図4:画像化実験の代表的な定量化。図3の実験セットアップからの画像を、真菌発芽および白血球の採用について分析した。(A)幼虫は、毎日発芽胞子の存在のために採点され、発芽を伴う幼虫の割合を計算した。(B,C,D)個々の幼虫は異なる色の線として表されます。食細胞クラスターの出現および大きさ(B)、マクロファージ募集(C)、および好中球募集(D)は、各幼虫に対する5日間の実験の過程で続いた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫における アスペルギルス 感染モデルについて説明する。 アスペルギルス 胞子は幼虫の後脳に微量に注入され、免疫抑制を誘導するために化学的処理が使用されます。感染進行は、毎日のイメージング設定を介して、真菌の成長および免疫応答、ならびにコロニー形成単位めっきによる生きた胞子の列挙を監視する。

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

4.0K ビュー.  Clemson University. このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫における アスペルギルス 感染モデルについて説明する。 アスペルギルス 胞子は幼虫の後脳に微量に注入され、免疫抑制を誘導するために化学的処理が使用されます。感染進行は、毎日のイメージング設定を介して、真菌の成長および免疫応答、ならびにコロニー形成単位めっきによる生きた胞子?...

ビデオ: Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

免疫・感染学

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex Vivoひと免疫不全ウイルス 1 における抗癌剤感受性との人間のリンパ組織と女性の性器粘膜の感染症

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

細菌感染や解析のためのキイロショウジョウバエ幼虫血球の抽出

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のアスペルギルス胞子の感染