ここで紹介する客観的な実験室の方法は、ヒトのアレルギー性接触皮膚炎を模倣するマウスの接触過敏反応を研究するのに役立つ可能性があります。接触過敏反応は、耳浮腫だけでなく、この反応に関与する細胞メカニズムの研究を可能にする様々な実験室試験によっても測定することができる。より接触性のある過敏症モデルは、さまざまな環境要因と新しい物質をテストして、テストされた要因がT細胞依存性免疫応答を調節するかどうかを示すことができ、新しい治療法の実施に使用できます。
かみそりの刃でマウスの皮膚を剃り、足にラベルを付けることから始めます。接触過敏症(CHS)の誘発の6時間前に、灰色の石鹸を水で塗り、マウスの胸部と腹部の2センチメートル四方の領域を剃ります。同じ日に、以前に剃った場所に150マイクロリットルの新しく調製した5%ハプテンを適用してマウスを感作します。
コントロールマウスでは、車両のみを適用します。動物をケージに戻す前に、ハプテンスポットを30秒間乾燥させます。4日目に、実験群を知らない観察者がゼロ時間でマイクロメーターを使用して麻酔をかけたマウスの耳の厚さを測定します。
次に、テストグループとコントロールグループの耳の両側に10マイクロリットルの作りたての04%ハプテンを塗布し、30秒間乾燥させます。前回の0.4%ハプテン塗布から24時間後の5日目に、24時間測定のために耳の厚さの測定を繰り返します。耳の厚さ測定の24時間後、マウスがまだ深い麻酔下にあるときに、ハサミを使用して頭蓋骨のできるだけ近い耳を切り落とします。
耳の遠位側で、生検パンチを使用して直径6ミリメートルのパンチを作ります。分析天びん上で各耳生検の重量を測定し、ミリグラムで表します。ミエロペルオキシダーゼ(MPO)アッセイでは、耳生検をステンレス鋼ビーズを備えた2ミリリットルの微量遠心チューブに入れ、500マイクロリットルの調製バッファーを追加します。
生検をホモジナイザーで10分間ホモジナイズし、次にサンプルを摂氏4度で15分間冷却してから、再び10分間ホモジナイズします。生検が均質化されたらビーズを取り出します。ホモジネートを摂氏マイナス20度で30分間凍結します。
サンプルを解凍してボルテックスし、均質化と凍結の手順を3回繰り返します。完了したら、ホモジネートを3, 000 Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。上清をピペットで回収してMPO活性を測定し、タンパク質1ミリグラムあたりの単位で表します。
血管透過性試験を行うには、0日目にマウスを感作し、4日目に、前述の手順を使用して耳にハプテンを適用して直接挑戦します。23時間後、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に1%エバンスブルー染料をグラム体重あたり8.3マイクロリットルを麻酔したマウスに静脈内注射します。1時間後、マウスに再度麻酔をかけ、前述のように耳生検を採取する。
組織から色素を抽出するには、1ミリリットルのホルムアミドを含むチューブ内で生検を摂氏37度、5%二酸化炭素の雰囲気中で18時間インキュベートします。耳の生検を収集した後、マウスがまだ深い麻酔下にあるときに、ピンセットで眼球を取り除きます。マウスに穏やかな圧力をかけ、後眼窩洞から血清採取のためにチューブに血液を採取します。
チューブを6回反転させ、血液が凝固するまで30分待ちます。次に、チューブを1, 300〜2, 000 Gで室温で10分間遠心分離します。前述の手順を使用して、0日目にTNCBハプテンでドナーマウスを感作します 4日目に、皮膚を消毒した後、鉗子を使用して麻酔をかけたマウスから腋窩リンパ節と鼠径リンパ節(ALN)を分離し、続いて脾臓を分離します。
2つの顕微鏡スライドのつや消しの端の間で組織をマッシュし、細胞懸濁液を孔径70マイクロメートルのセルストレーナーに通します。次に、1%ウシ胎児血清を添加したDPBSで細胞を洗浄し、摂氏4度で10分間300Gで遠心分離します。上清をデカントし、残りの細胞ペレットを1〜5ミリリットルのDPBSに再懸濁します。
ALNと脾臓の1:1の混合物を調製して、200マイクロリットルのDBPSで10〜7番目の細胞の7.0倍までの濃度を達成してから、麻酔をかけたマウスにCHSエフェクター細胞の混合物を静脈内注射します。ゼロ時間とチャレンジの24時間後に耳の厚さを測定します。データは、TNCBに感作し、4日後に耳に挑戦したマウスは、偽感作され、同様に挑戦された対照マウスと比較して、耳の腫れが有意に増加したことを示しました。
試験群における耳浮腫の増加は、耳重量、MPO活性、耳抽出物中のインターフェロンガンマ濃度、組織学的検査における真皮浮腫の変化、および耳血管透過性の増加をもたらし、対照動物と比較した場合、試験マウスの血清においてTNP特異的IgG1抗体が上昇した。以前にTNCBで感作したドナーからCHSエフェクター細胞を投与された動物は、細胞を受け取らなかった動物と比較して、有意に増加した耳の腫れを示しました。最も重要な瞬間は、接触過敏症を引き起こすことです。
ハプテン溶液は非常に揮発性で光に敏感であるため、動物の皮膚にすばやく塗布する必要があります。単離されたエフェクター細胞に対して追加の試験を実施することができる。例えば、細胞培養物は、抗原の存在下で増殖する能力を評価するために確立され得る。
