Burada sunulan objektif bir laboratuvar yöntemi, insanlarda alerjik kontakt dermatiti taklit eden farelerde kontakt aşırı duyarlılık reaksiyonunun incelenmesine yardımcı olabilir. Kontakt aşırı duyarlılık reaksiyonu sadece kulak ödemi ile değil, aynı zamanda bu reaksiyonda yer alan hücresel mekanizmaların incelenmesine izin veren çeşitli laboratuvar testleri ile de ölçülebilir. Daha fazla temas içi aşırı duyarlılık modeli, test edilen faktörlerin yeni tedavileri uygulamak için kullanılabilecek T hücresine bağımlı bağışıklık tepkilerini modüle edip etmediğini göstermek için çeşitli ve çevresel faktörleri ve yeni maddeleri test edebilir.
Fare derisini bir tıraş bıçağı ile tıraş ederek ve pençeyi etiketleyerek başlayın. Kontakt aşırı duyarlılığın veya CHS'nin indüksiyonundan altı saat önce, gri sabunu suyla uygulayın ve farenin göğsünde ve karnında iki santimetre karelik bir alanı tıraş edin. Aynı gün, daha önce tıraş edilen noktaya 150 mikrolitre taze hazırlanmış% 5hapten uygulayarak fareleri hassaslaştırın.
Kontrol faresinde, sadece aracı uygulayın. Hayvanı tekrar kafese koymadan önce hapten noktasını 30 saniye kurutun. Dördüncü günde, anestezi uygulanan bir farenin kulak kalınlığını, deney gruplarından habersiz bir gözlemci tarafından sıfır saatte bir mikrometre kullanarak ölçün.
Daha sonra test ve kontrol gruplarında kulakların her iki tarafına taze hazırlanmış %04 hapten 10 mikrolitre uygulayın ve 30 saniye kurumasını bekleyin. Beşinci günde, önceki %0,4 hapten uygulamasından 24 saat sonra, 24 saatlik ölçüm için kulak kalınlığı ölçümünü tekrarlayın. Kulak kalınlığı ölçümünden 24 saat sonra, fare hala derin anestezi altındayken, makas kullanarak kulakları kafatasına mümkün olduğunca yakın kesin.
Kulakların distal tarafında, biyopsi zımba kullanarak altı milimetre çapında bir yumruk yapın. Her kulak biyopsisinin ağırlığını analitik terazide ölçün ve miligram cinsinden ifade edin. Miyeloperoksidaz veya MPO için, tahlil olarak, kulak biyopsilerini paslanmaz çelik boncuklu iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne koyun ve hazırlanan tamponun 500 mikrolitresini ekleyin.
Biyopsileri bir homojenizatörde 10 dakika homojenize edin ve ardından numuneyi 10 dakika boyunca tekrar homojenize etmeden önce 4 santigrat derecede 15 dakika soğutun. Biyopsiler homojenize edildikten sonra boncukları çıkarın. Homojenatları eksi 20 santigrat derecede 30 dakika dondurun.
Numuneleri çözdürün ve vorteksleyin ve homojenizasyon ve dondurma prosedürünü üç kez tekrarlayın. Tamamlandığında, homojenatı 3.000 G'de 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj edin. MPO aktivitesini ölçmek için süpernatantı bir pipetle hasat edin ve bir miligram protein başına birimler halinde ifade edin.
Bir vasküler geçirgenlik testi yapmak için, sıfır gününde fareleri hassaslaştırın ve dördüncü günde, daha önce belirtilen prosedürü kullanarak kulaklara hapten uygulayarak doğrudan meydan okuyun. 23 saat sonra, anestezi uygulanan fareye intravenöz olarak Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde veya DPBS'de% 1 Evans mavi boyasının gram vücut ağırlığı başına 8.3 mikrolitre enjekte edin. Bir saat sonra, daha önce açıklandığı gibi, kulak biyopsilerini toplamak için fareyi tekrar uyuşturun.
Boyayı dokudan çıkarmak için, biyopsileri 18 saat boyunca% 5 karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede bir mililitre formamid içeren tüplerde inkübe edin. Kulak biyopsilerini topladıktan sonra, fare hala derin anestezi altındayken, göz küresini cımbızla çıkarın. Fareye hafif bir baskı uygulayın ve serum toplanması için retro-orbital sinüsten tüpe kan toplayın.
Tüpü altı kez ters çevirin ve kanın pıhtılaşması için 30 dakika bekleyin. Ardından, tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.300 ila 2.000 G'de santrifüj edin. Donör fareleri daha önce bahsedilen prosedürü kullanarak sıfır gününde TNCB hapten ile hassaslaştırın Dördüncü günde, cildi dezenfekte ettikten sonra, aksiller ve inguinal lenf düğümlerini veya ALN'leri forseps kullanarak anestezi uygulanan fareden izole edin, ardından dalağı izole edin.
İki mikroskop slaytının buzlu uçları arasındaki dokuyu ezin ve hücre süspansiyonunu 70 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir hücre süzgecinden geçirin. Daha sonra, hücreleri% 1 fetal sığır serumu ile desteklenmiş DPBS ile yıkayın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin. Süpernatantı boşaltın ve kalan hücre peletini bir ila beş mililitre DPBS içinde yeniden askıya alın.
CHS-efektör hücrelerin karışımını anestezi uygulanmış bir fareye intravenöz olarak enjekte etmeden önce, 200 mikrolitre DBPS'deki yedinci hücrelere 7.0 kat 10'a kadar bir konsantrasyon elde etmek için 1: 1'lik bir ALN ve dalak karışımı hazırlayın. Kulak kalınlığını sıfır saatte ve meydan okumadan 24 saat sonra ölçün. Veriler, TNCB'ye duyarlı hale gelen ve dört gün sonra kulaklara meydan okuyan farelerin, sahte duyarlı ve daha sonra benzer şekilde zorlanan kontrol farelerine kıyasla, önemli ölçüde artmış kulak şişmesi geliştirdiğini gösterdi.
Test grubunda kulak ödemindeki artış, kulak ağırlığının artmasına, MPO aktivitesine, kulak ekstraktlarında interferon gama konsantrasyonuna, histolojik incelemede ödemli dermis değişikliklerine ve kulak vasküler geçirgenliğine neden oldu TNP-spesifik IgG1 antikorları, kontrol hayvanlarıyla karşılaştırıldığında test farelerinin serumlarında yükselmiştir. CHS-efektör hücrelerini daha önce TNCB ile hassaslaştırılmış donörlerden alan hayvanlar, hücreleri almayan hayvanlara kıyasla önemli ölçüde artmış kulak şişmesi göstermiştir. En kritik an, temas aşırı duyarlılığını tetiklemektir.
Hapten çözeltisi çok uçucu ve ışığa duyarlıdır, bu nedenle hayvanların derisine hızlı bir şekilde uygulanmalıdır. İzole efektör hücreler üzerinde ek testler yapılabilir. Örneğin, antijenlerin varlığında çoğalma yeteneğini değerlendirmek için hücre kültürleri kurulabilir.
