この方法では、従来のMEAの細胞内同様の活動電位を記録することができ、それによってAP形状のより良い記述と不整脈誘発電位のより敏感な分類が可能になります。典型的な電界電位記録と比較して、細胞内の実際の電位形状は、下にあるイオンチャネルの正確な承認についてより多くの洞察を提供します。本方法は、幹細胞技術により臨床患者由来の心筋細胞に適用することで、原因診断、および不整脈などの心疾患のパーソナライズに寄与することができ、当社の技術者であるKarin Gebhardtが心筋細胞培養を実証します。
以前にオートクレーブ処理したMEAの電極場のコーティングを開始するには、層流フードの下に10マイクロリットルのピペットを使用してフィブロネクチンを滴下します。浸透圧ショックを軽減するために、融解心筋細胞を入れた50ミリリットルのチューブにめっき液を90秒間滴下します。8ミリリットルのメッキ培地をチューブに静かに加え、細胞懸濁液を注意深く混合します。
10ミリリットルのピペットを使用して上清を取り除き、ペレットを廃棄しないようにし、細胞数を最終濃度に調整します。セル着座前に、10マイクロリットルのピペットを使用して、塗布されたコーティング溶液をMEA電極領域から除去します。コーティングシードの乾燥を避けるために、6つのウェルMEAと1つのウェルMEAの両方の電極フィールドに4マイクロリットルのセルを滴下することにより、セルをすぐに乾燥させ、セルを摂氏37度で1時間接着させ、5%二酸化炭素。
層流フードの下に、摂氏37度に加熱した200マイクロリットルと1ミリリットルの滅菌めっき媒体をそれぞれ6つのウェルMEAとシングルウェルMEAに追加します。MEA記録の場合は、MEAチップホルダーを対物レンズの穴の中央に配置して、MEAシステムをデバイスの上に配置します。次に、対物レンズがMEAシステムの穴の真下になるように、MEAセットアップを配置してレーザーを電極に焦点を合わせます。
細胞が機械的障害から回復できるようにするには、記録の15分前に培養細胞を含むMEAチップをインキュベーターからMEAセットアップに移します。次に、イソプロパノール綿棒を使用してコンタクトパッドとピンを慎重に清掃し、ノイズレベルを下げます。MEAをMEAセットアップに慎重に配置し、右側にシリアル番号が見える6ウェルMEAチップ、または左側に参照電極が付いたシングルウェルMEAチップを配置します。
次に、MEAシステム統合加熱を摂氏38度に設定します。統合された安全スイッチは、MEAチップの上で蓋が閉じられている場合にのみレーザーをアクティブにするため、デバイスの蓋を閉じます。MEA設定プログラムを使用して、ハイパスとローパスのMEAシステムフィルタをそれぞれ0.1ヘルツ以下と3, 500ヘルツに設定します。
録音には、MCラックソフトウェアまたは代替ソフトウェアを使用してください。実験に応じて入力範囲を調整します。信号がアンプとサンプリングレートを飽和させないようにします。
ソフトウェアの長期表示機能を使用して、記録を確認します。MEAチップをMEAセットアップに挿入し、ソフトウェアをセットアップした後、FBALPソフトウェアを使用してレーザー力学を初期化します。次に、初期化ボタンをクリックします。
初期化の最後に、仮想レーザーポイントは、6ウェルMEAの場合はウェルDに、1ウェルMEAの場合は左下にあります。次に、マウスクリックでコントロールキーを使用して、仮想レーザーポイントをD 5電極の中央に移動し、コントロールキーを押しながらマウスホイールでスクロールしてフォーカスを調整します。または、オートフォーカス機能を使用します。
ボタンを押すと、仮想レーザーポイントが自動的にウェルFに移動します。実験要件に応じてレーザー出力と処理時間を調整します。レーザーを有効にするには、レーザーオンとして表示されるレーザーオフボタンをクリックし、録音ソフトウェアに切り替えます。
ファイル名を選択し、赤い録音ボタンをクリックしてから、ウィンドウ上部の再生ボタンをクリックして測定値を記録します。レーザーでセルを開く前に、60秒間ベースラインを記録します。初期化ソフトウェアに戻り、ソフトウェアウィンドウの右側にある仮想マップでレーザーによって除外される電極を無効にします。
レーザーを開始するには、Altマウスクリックを使用して、このウェルの中心電極を選択します。これにより、このウェルの各電極上のセルを自動的に開くレーザーを開始し、この選択されたウェルの以前に活性化された電極をすべて開くために各ウェルについて繰り返す。ミリモル濃度のニフェジピンE-40 31、およびドフェチリドを最初にDMSOに溶解し、次に完全培地に所望の濃度の10倍に溶解する。
ウェル内の最終DMSO濃度0.1%を超えないようにしてください。ベースラインアクティビティを60秒間記録します。前に示したようにレーザー誘起ペレーションを開始し、FPSをliAPに変換します。
すべての薬をウェルあたりの単一濃度として適用します。6ウェルとシングルウェルのMEAからそれぞれウェルあたり20マイクロリットルと100マイクロリットルの培地を除去します。測定する原薬20マイクロリットルまたは100マイクロリットルをウェルに加えます。
MEAの種類にもよりますが、慎重に上下に2〜3回ピペットで入れます。コンパウンドを300秒間洗い流します。この間、liAP形状がFP形状に変形することがあります。
ここでも、誘導されたレーザー誘発ペレーションを行い、liAP上の可能性のある化合物誘発欠陥をさらに60秒間記録します。ニフェジピンの添加は、濃度依存的にliAPのプラトー相を減少させ、それによってliAP全体を短縮した。この短縮は、操作されていない電極からの心筋細胞の電界電位に匹敵しました。
E-40 31は、関連するKV一点11カリウムチャネルの再分極を阻害し、増加した濃度で心筋細胞の不整脈挙動を引き起こした。また、E-40 31は濃度依存的にliAP持続時間を増加させた。LiAPの終わりには、0.1マイクロモルで小さな正の電圧偏向が観察され、これは高濃度でより顕著になり、EADと呼ばれる一時的な新しい脱分極を示しています。
0.1マイクロモルの最高濃度では、これらのEADは時間の経過とともに異所性拍動にエスカレートしました。これは時期尚早の活動電位です。EADと異所性拍動は、不整脈活動の重要な指標です。
そして結局、電気的活動は不整脈拍動をもたらします。濃度応答関係は、FPおよびliAP記録と相関した。さらに、ドフェチリドの存在下では、FPとliAPの両方が同じウェル内で約2秒の持続時間を示し、FP波形は規則的な再分極偏向を示した。
liAPにいる間、EADは検出可能です。焦点が合っていない顕微鏡画像が細胞の開口部に影響を与える可能性があるため、各メロメンの前に焦点を調整することが重要です。また、活動電位は、オプターペレーションを分析に使用する必要がある直後に取得されます。
この技術は、標準的なMEAと比較して、以前の不整脈効果の検出においてより感度が高く、有害な化合物効果をより正確に検出することができます。
