パイロシーケンシングは、ミトコンドリアDNAの一塩基多型の遺伝子型決定に使用できる合成技術によるシーケンシングです。この方法は、他のシーケンシング方法と比較して、実装が容易で費用対効果が高いという点で有利です。ミトコンドリアDNA中の病原性多様体のヘテロプラスミー値を決定することにより、特定のミトコンドリア病の診断方法として簡単に使用できます。
まず、遺伝子型決定される種のミトコンドリアDNA配列ファイルを取得し、一塩基多型(SNP)の位置を特定します。使用する参照配列が、SNPの位置を容易に識別できるように、研究された変異に適切な塩基番号付けを採用していることを確認してください。SNPサイトの上流および下流に1, 000塩基対をコピーし、切捨てた配列をパイロシーケンシングプライマー設計ソフトウェアに貼り付けます。
多型塩基を強調表示して右クリックし、[ターゲット領域の設定] を選択して、分析された SNP 塩基をパイロシーケンシングアッセイのターゲットとして設定します。インターフェースの右上隅にある再生アイコンを押してプライマー選択を開始し、ソフトウェアがプライマートリオ、テンプレートDNAの予備増幅用の2つのプライマー、およびパイロシークエンシングマシンでの合成によるシーケンシング用の3番目のプライマーを自動的に生成するのを待ちます。右クリックしてすべてのプライマーセットをコピーを選択し、すべてのプライマーセットを保持します。
パイロシーケンサーに付属のランソフトウェアを開き、新規アッセイを選択してから、対立遺伝子定量アッセイテンプレートを選択します。シーケンシングプライマーの直下流にヌクレオチドを入力して、対応するボックスに分析する配列を入力します。可変位置については、スラッシュで区切られた2つの可能な基数を示します。
[分注順序の生成]を押すと、合成反応によるシーケンシングで分注するヌクレオチドの適切な順序をソフトウェアが自動的に決定します。保存し、アッセイの名前を指定します。次に、分析対象のDNAをマイクロリットル当たり5ナノグラムに希釈してランを実行する。
最初の実行では、既知のヘテロプラスミーのサンプルを基準として、野生型サンプルを含めるようにしてください。次に、増幅プライマーとパラメーターを使用して、5マイクロリットルの希釈DNAと25マイクロリットルの反応のプレシーケンシングPCRを実行します。ファイルのセットアップを実行するには、パイロシーケンサー ソフトウェアで [新しい実行] を選択します。
パイロシーケンサーは、パイロシーケンシングディスク上の単一のシーケンシングウェルを表す空の正方形で、48の別々のプリアンプ反応を同時にシーケンスできます。四角形を右クリックしてLoad Assayを選択することにより、アッセイをロードします。必要に応じて、異なるシーケンシングプライマーで最大4つのアッセイをシーケンシングできます。
プライマーディスペンセーションモードを自動に設定すると、ランに使用されるシーケンシングプライマーごとに注入チャンバーが自動的に割り当てられます。1つのシーケンシングディスクで4種類のアッセイを実行する場合を除き、ランモードを標準に設定します。ランテンプレートファイルのアッセイ数が、増幅されるPCR反応の数と一致していることを確認します。
次に、実行ファイルをUSBドライブに保存します。パイロシーケンサーをプライミングするには、デバイスのメインタッチスクリーンにあるクリーニングボタンを押し、画面の指示に従って、すべてのインジェクターを高純度の水でクリーニングします。吸収ストリップを機械に挿入するときは、端が9時の位置で接触していることを確認してください。
USBスティックを接続した後、シーケンスボタンを押して、前に準備した実行ファイルをロードします。デバイスの指示に従って、必要に応じて試薬をマシンの対応するインジェクターにロードしてプライミングします。3マイクロリットルのビーズをウェルにロードし、次に10マイクロリットルの各PCR反応をロードして、対応するサンプルにシーケンスします。
上下にピペットで移動し、サンプルを磁気ビーズと混合します。プライミングされたパイロシーケンサーで、ディスクをマシンにロードできるという表示を探します。プレート保持ナットを緩め、ロードされたサンプルプレートをディスクコンパートメントの金属ピンに合わせます。
プレートがプレートコンパートメントにしっかりとねじ込まれたら、タッチスクリーンインターフェイスのスタートボタンを押してシーケンスランを開始します。実行が完了したら、マシンからUSBドライブを取り外し、パイロシーケンサーソフトウェアを実行しているコンピューターに接続し直します。新しく生成された実行ファイルがUSBドライブに表示されたら、実行結果ファイルをダブルクリックします。
これにより、ヌクレオチド組み込み時の各ウェルのルシフェラーゼ出力を自動的に分析し、目的のミトコンドリア対立遺伝子を定量化します。読み取りの品質に基づいてソフトウェアによって表示されるカラースコアを探します。結果を保存するには、上部のウィンドウで[レポート]を選択し、続いて[完全なレポート]を選択して、実行の各ウェルからのパイログラムと結果を含むPDFファイルを生成します。
または、[レポート] タブで他の形式で結果をダウンロードします。この図に示すようにm.3243A>G変異に対して選択された両方のセットからの増幅プライマーを用いたPCR増幅のアガロースゲル電気泳動。
ここで、Hetは、分析されるほぼホモプラズムm.3243A>Gサンプルを示す。キャリブレーションにモル標準を使用した両方のプライマーセットの性能の比較をこの図に示します。
測定値は縦の点線で示しています。X=Y線形関数が表示され、テストされた2つのアッセイのそれぞれが理想的な測定値にどれだけ近いかが示されます。X軸上の細胞株の名前は、このアッセイを用いて遺伝子型決定された様々なサイブリッドクローンの名前である。
両方のアッセイを用いた未知のm.3243A>Gヘテロプラスミーの4つのサイブリッドクローンのジェノタイピング結果をここに示す。配列決定は、技術的なトリプリケートで行った。
ミトコンドリアジンクフィンガーヌクレアーゼ処理細胞、未処理および模擬処理コントロールのジェノタイピング結果、および結果の生成に使用された2つのMEF細胞サンプルPCR複製および野生型ジェノタイピングコントロールからのパイログラムをここに示します。パイロシークエンシングは、ミトコンドリアDNAのさまざまな遺伝子治療技術を評価するための遺伝子治療実験の読み出しとして使用できます。
