光線力学療法(PDT)は、癌治療にいくつかの利点を提供し、その有効性は光増感剤を活性化する光源に依存します。この分野では最近の進歩があるが、in vitroモデル用のPTD用の高価で再現性のあるデバイスへのアクセスが不足している。この需要を達成するために、この研究では、PhotoActという名前の細胞培養でPDTアッセイを実行するための新しい、シンプルで低コストのデバイスについて説明します。
建設を開始するには、厚さ3ミリメートルの中密度繊維板MDFを見て、次の寸法のピースを入手しました。次の寸法の2つのボックスを作成します。大きい方の箱の背面にドリルで穴を開けて、バレルジャックコネクタを取り付けます。
また、大きな箱の上部、小さい箱の上部と下部にドリルで穴を開けて、電気ケーブル用の通路を提供します。すべての内面を黒インクでペイントして、均一な光入射を促進します。小さい方のボックスの上部内面に、それぞれ10個のLEDが付いた3つのLEDテープを並列に取り付けます。
さらに、小さい方の箱の底面の内面の中央に明るさセンサーを取り付けます。補足3D印刷ファイルを使用して、コントロールユニットの構造を印刷します。すべてのコンポーネント、電源ボタン、ポテンショメータ、タイムスタートタッチパッド、LED、輝度センサー、LCD、ブザー、電源、およびコントロールユニット内部に取り付けられたESP-32コントローラーボードの部品を取り付けます。
補足ファイルで利用可能なプログラミングコードをアップロードし、テストを実行して、すべての接続が機能していることを確認します。ボックスを組み立てて固定し、隙間を防ぎ、その結果、外部照明の干渉や即時の光の損失を防ぎます。マウントされたコントロールユニットをプロトタイプの上部にあるドリル領域に取り付けます。
次の寸法で同じ材料のフロントドアを構築し、ヒンジとベルクロテープで外箱に固定して、チャンバーの閉鎖と中断のないアッセイを保証します。また、フロントドアを簡単かつ正確に操作するためのハンドルを取り付けます。プロトタイプの下部に4つのゴム製フットパッドを取り付けて、操作中の安定性を高めます。
ダルベッコ改変イーグルミディアム低グルコースでHeLa細胞株を、10%のウシ胎児血清と1%のゲンタマイシンで培養します。培養フラスコを二酸化炭素の5%と摂氏37度に保ちます。コンフルエントの80〜90%に達するまで細胞培養を管理および検査します。
播種プロセスで細胞生存率プロトコルを開始します。コンフルエントなHeLa細胞培養でフラスコから培地を取り出します。フラスコをリン酸緩衝生理食塩水、PBSで洗浄し、強調表示された詳細に従ってトリプシンで培養物を剥離します。
血球計算盤で再懸濁細胞を数え、ウェルあたり20, 000細胞の濃度でマルチウェルマイクロプレートに播種します。暗色と明色の処理条件用に2枚のプレートを準備し、細胞付着まで24時間インキュベートします。光増感剤による処理を進めるには、両方のプレートから培地を取り出し、100マイクロリットルの濃度上昇中のVerteporfinで細胞を処理します。
細胞を24時間処理して、バーテポルフィンのインターナリゼーションを可能にします。インキュベーション後、処理液を取り除き、細胞をPBSで洗浄し、薬物を含まない培地を加えます。1枚のマイクロプレートをアルミホイルで覆い、光にさらされないように保護し、24時間インキュベートします。
このマイクロプレートは、PDT結果をさらに分析するためのコントロールデータを提供します。もう一方のマイクロプレートは、フォトアクトで露光条件で利用されます。機器を操作するには、電源ボタンを押してコンセントに差し込み、電源を入れます。
マルチウェルマイクロプレートをPDTチャンバーに置き、前面ドアをサイドベルクロテープで固定して装置を閉じます。機器をセットアップするには、ポテンショメータを使用して発光のRGB構成を調整します。プラス/マイナスタッチパッドを押して、時間構成を調整し、アッセイ時間を設定します。
アッセイに関する正しい情報がディスプレイに表示されているかどうかを確認し、必要に応じて最終調整を行います。スタートタッチパッドを押してアッセイを開始します。実験の開始時にビープ音が1回鳴るブザーが聞こえる必要があります。
実験中は、照度や残り時間などの進行状況情報をディスプレイで確認できます。PDTアッセイ中は、フロントドアを開けたり、構成を変更したりしないでください。アッセイの最後に、ビープ音が4回鳴り、電子システムがすべてのLEDをオフにします。
完成したメッセージと実験中に膨張した最終的なエネルギー量をディスプレイで観察できます。フルエンスの最終値は、強調表示された式に従って計算されます。光にさらされたマイクロプレートを覆い、24時間のインキュベーションを続行します。
インキュベーション期間後、両方のプレートから培地を取り出し、単層の細胞をPBSで洗浄し、MTT溶液を加えます。ホルマザン結晶を形成するために、暗いプレートと明るい条件の両方で4時間インキュベートします。MTT溶液を注意深く取り除き、紫色の結晶をDMSOとエタノール溶液で溶解します。
結晶が完全に溶解した後、595ナノメートルでマイクロプレートリーダーを用いて吸光度測定を行う。最終製品は、可視光の異なるスペクトルを放出するようにプログラムされた30個の散乱発光ダイオード、LEDのセットを備えた上部内面を備えた暗いチャンバーで構成されています。内面の反射率が低く、LED構成が均一に分布しているため、均一な光入射が確立されます。
セットアップインターフェースはユーザーフレンドリーで、落ち着いた実験条件は再現可能でした。概念実証として、このデバイスは、光曝露後の2D HeLa細胞培養におけるバーテポルフィンの細胞毒性効果を高めるために使用されました。図に示すように、GI50値は光条件に対して3.1マイクロモルであった。
暗条件の場合は13.8マイクロモル したがって、条件を比較する効率の4倍以上の増加は、光増感剤としてのバーテポルフィンの使用とPDTアッセイへのPhotoActの適用性を確認します。この研究で説明されているプロトタイプの使用を検証するために、光増感剤、細胞、フルエンスを含む同じ実験条件下で市販のPDTデバイスを使用し、結果を比較しました。図に示すように、両方のデバイスは、バーテポルフィンを等しく光活性化し、細胞毒性効果を高めます。
最後に、光曝露後のバーテポルフィンによって引き起こされるROS媒介細胞死を、DCFDAアッセイを用いたフローサイトメトリーによって確認した。要約すると、このデバイスは、総コストが50未満の市販の低コストコンポーネントで簡単に構築できました。この装置の他の主な利点には、携帯性、低メンテナンス需要、複数のタイプの培養プレートを照射する能力、アッセイごとに最大4ユニットの同時使用、正確で再現性のある照射、コンピュータや他のマシンへの接続を必要としないユーザーフレンドリーでシンプルなセットアップインターフェースが含まれます。
さらに、操作中に問題やエラーを見つけて修正するための体系的な問題解決アプローチを提供するために、意思決定フローチャートが提示されます。これらの知見は、PDTを促進するPhotoActの利点を科学研究に拡大し、光増感剤の作用機序とその臨床応用を探求することを可能にする。
