カンジダ・アルビカンスを阻害するローズベンガル媒介光線力学療法

この研究は、様々な微生物や細胞に対するさまざまな光力学的影響を調べるためのシンプルで汎用性が高く、簡単なシステムです。このシステムでは、LEDを実験計画に応じて異なる配置に収めることができます。PDTの異なる条件は、1回の実験で96ウェルプレートまたは384ウェルプレートでも計算することができる。

この技術は真菌性角膜炎の治療に使用でき、そのために世界的には、集中的な治療にもかかわらず約150,000人が目を失います。まず、LEDストリップから4つの緑色LEDを切り取り、96ウェルプレートの3つのウェルに合わせます。LEDのフルエンス率を540ナノメートルでライトパワーメーターで測定します。

照射中はプレートの横に組み立てた扇風機で25°Cで一定の温度を維持してください。滅菌ループを用いて、寒天プレートからカンジダ・アルビカンスの単一のコロニーを選び、3ミリリットルのYPD培地を含む滅菌ガラス管に加える。チューブを摂氏25度、回転速度155RPMで14~16時間インキュベートし、酵母培養物を増殖させる。

次にYPD培地で一晩培養した値をOD600値0.5に希釈する。30°Cで155RPMで回転しながら4時間インキュベートして、対数成長期を達成します。新鮮なYPD培地で対数期培養の希釈をOD600値0.65まで繰り返し、1ミリリットル当たり約1回~第7コロニー形成単位を得た。

同時に1X PBS中のバラベンガルの4%ストック溶液を調製する。フィルターは0.22マイクロメートルのフィルターで滅菌します。1ミリリットルの対数期培養に111マイクロリットルの2%バラベンガル溶液を加え、室温で異なる時点で共培養して、細胞内のRBの吸収を理解する。

16で遠心分離し、室温で2時間半の間Gを100倍にし、そして共培養物を1ミリリットルの1X PBSで3回洗浄した。洗浄後、カンジダ・アルビカンス培養物を1ミリリットルの1X PBSに再懸濁する。各条件について、培養物を96ウェルプレート中の3つの異なるウェルに分配する。

ウェルをLEDアレイに合わせます。光が当たったグループで、扇風機とライトをオンにします。照射後、1ウェルから共培養液20マイクロリットルを採取し、180マイクロリットルの1X PBSを入れたチューブに添加して10倍段階希釈を2回行う。

次いで、YPD寒天プレートの1象限に各段階希釈液の20マイクロリットルを滴下し、プレート上に計数可能なコロニーを得た。蛍光顕微鏡は、赤色蛍光下でのバラベンガルによるカンジダ・アルビカンスの即時染色を示した。インキュベーションの15分後、細胞の大部分がバラベンガルで染色され、時間依存的に細胞に入ることを示す。

また、光によるバラベンガルの活性化は、細胞内でフリーラジカルや一重項酸素を生成し、細胞死を生じる。バラベンガルまたは照射の非存在下では、細胞死は観察されなかった。カンジダ・アルビカンスは、0.2%バラベンガルの存在下での緑色光照射後、光用量依存的に阻害された。

最初に96ウェルプレートをLEDの中心に合わせることが重要です。第二に、使用される寒天プレートは、別々のコロニーの混合を防ぐために十分に乾燥されなければならない。プレート上で成長したカンジダ・アルビカンスは、PDTが細胞の遺伝子発現にどのように影響するかを答えることができる遺伝子分析のためにさらに送ることができる。

これらの技術は、PDTが癌細胞、細菌、真菌、またはウイルスのいずれかの異なる細胞タイプに対して、簡単で安価で汎用性の高いプラットフォームでどのように機能するかを調べる道を開きます。