AirIDは、タンパク質間相互作用のための貴重な酵素であり、他の近接標識酵素よりも時間のかかるプロセスで毒性やエラーが少なくなります。APRR2-AirIDタンパク質をモデルとして、キュウリまたはCucumis sativusの近接標識実験を実施するためのステップバイステップAT4G18020プロトコルが提示されます。この手順を実演するのは、私の研究室のAhmad Zada氏、Imran Khan氏、Yuting Cheng氏、Min Zhang氏です。
Cucumis sativusまたはキュウリの種子を水中に移し、摂氏50度で20分間インキュベートし、種子をペトリプレートの濾紙の上に12〜16時間置きます。その後、種子を土の入った鉢に移し、摂氏23度の気候室で、光16時間、暗光18時間の撮影期間で3〜4週間育てます。2.5マイクロリットルのプラスミドEarleyGate 100をアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株のコンピテントセルに移します。
チューブを氷上で30分間インキュベートしてから、液体窒素に3分間移します。ヒートショックを与えるには、チューブを摂氏37度のインキュベーターに5分間移します。次に、チューブを氷上に2分間置きます。
熱ショックを受けたアグロバクテリウム細胞に1, 000マイクロリットルのLuria BertaniまたはLB培地を加えます。細胞を摂氏30度、118RPMで1時間インキュベートした後、3000Gで摂氏4度で2分間遠心分離します。次に、800マイクロリットルの上清を捨て、残りの溶液を混合します。
カナマイシンとゲンタマイシンをそれぞれ50マイクログラム/ミリリットル、リファンピシン/ミリリットルあたり25マイクログラムを添加したLB培地にプレートします。プレートを摂氏30度で48時間インキュベートします。プレートからいくつかの細菌コロニーを拾います。
それらを適切な抗生物質を添加したLB液体培地に入れ、液体LBを摂氏30度、218RPMで36〜48時間インキュベートします。摂氏4度で3、000 Gで2分間遠心分離した後、ペレットを農業浸潤バッファーに再懸濁して、光学濃度を600ナノメートルの波長で1に調整します。1ミリリットルの針なし注射器を使用して、1.5ミリリットルの再懸濁したアグロバクテリア接種物をアキシャル表面の表皮全体に浸潤させます。
植物を摂氏23度に保ち、毎秒75マイクロモル/メートル平方の光で16時間、暗い条件で8時間、36時間後、すでにろ過された葉に5マイクログラムのビオチン1ミリリットルを浸透させます。ビオチンが4〜12時間浸潤した後、葉を刈り取り、タンパク質の分解を避けるために液体窒素にすばやく移します。乳棒と乳鉢を使用して葉を挽き、pH 7.4のPBS BSAを2ミリリットルすばやく加え、続いてゆっくりと粉砕します。
サンプルミックスを15ミリリットルのコニカルチューブに移し、その上に置かれた急速ろ過材料フィルターに通し、チューブを氷上に保持します。サンプルを2ミリリットルのチューブに移します。1%プロテインインヒビターカクテルを加え、チューブを7〜8回上下させて内容物を混合してから遠心分離します。
完了したら、上清を新しい2ミリリットルのチューブに移し、10%β-D-マルトシドを加えます。チューブを氷上に 5 分間置いてから、摂氏 4 度で 20 、 000 G で 10 分間遠心分離します。脱塩カラムを平衡化するには、カラムの片側に印を付け、印を付けた面を外側に向けて遠心分離します。
カラムの上部カバーと下部カバーを取り外し、摂氏 4 度で 1, 000 G で 2 分間遠心分離します。カラムの回収チューブから液体溶液を廃棄し、前に示したように遠心分離でチューブを 5 ミリリットルの PBS バッファーで少なくとも 5 回洗浄します。1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルのPBS BSAと50マイクロリットルのストレプトアビジン-C1結合磁気ビーズを加え、完全に混合します。
チューブをマグネットスタンドに3分間置き、ビーズをチューブの片側に向けて吸収します。反対側から上清を捨て、このPBS BSA洗浄を3回繰り返します。ビオチン化タンパク質を濃縮するには、2 ミリリットルのサンプルをカラムに添加します。
カラムを 1000 G で摂氏 4 度で 8 分間遠心分離した後、1 ミリリットルの脱塩タンパク質抽出物を 50 マイクロリットルのストレプトアビジン-C1 標識磁気ビーズに加えます。磁気ビーズの入ったチューブを回転子の上に常速および室温で30分間置いて、溶液を完全に混合します。次に、ビーズを磁気ラックに室温で3分間、またはチューブの片側に集まるまで置きます。
上澄み液を静かに取り除き、1ミリリットルの洗浄バッファー1を加えます。回転子の上でチューブを2分間回転させ、磁気ラックで行ったステップを繰り返して上清を除去します。同様に、前述したように、1ミリリットルの洗浄バッファー2および3で洗浄を行います。
次に、1.7ミリリットルの50ミリモルトリス塩酸塩を添加し、磁気ラックで行ったステップを繰り返して、洗浄バッファー中の界面活性剤を除去します。1ミリリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウム緩衝液を使用して、それぞれ2分間の洗浄を6回行います。完了したら、50ミリモルのトリス塩酸塩、12%スクロース、2%ラウリル硫酸リチウム、および1.5%ジチオスレイトールを含む50マイクロリットルのタンパク質抽出物をビーズに加え、チューブを摂氏100度のインキュベーターに5分間入れてヒートショックを与えます。
磁気ラックでこのステップを繰り返した後、LCMS/MS分析のために上清をマイナス80°Cで保存します。抽出したタンパク質のウェスタンブロット解析では、浸潤したキュウリの葉でタンパク質の発現とビオチン化が成功していることが示されました。対照群と比較して、標識タンパク質の発現レベルが高く、バンド数が多いことから、AirIDによる目的遺伝子の標的タンパク質のタグ付けに成功したことが確認されました。
結果は、すべての形質転換サンプルでAnti-Flag抗体を含む標的バンドを示すAnti-Flag抗体およびAnti-Mass抗体を使用して確認されました。ビオチン化タンパク質をストレプトアビジン-C1結合磁気ビーズで濃縮した後、サイズの異なる複数のタンパク質が観察されました。すべての結果から、AirIDは植物のタンパク質間相互作用を分析するための新しい理想的な酵素であると結論付けられました。
近接標識実験では、5マイクロモルのビオチンとHR持続時間が理想的であることを覚えておくことが重要です。このプロトコルでは、葉のサンプルの調製、プレビオチンの除去、抽出タンパク質の定量化、ビオチン化タンパク質の濃縮など、植物におけるAirIDベースの近接ラベリングの段階的なセットアップの概要を説明しています。AirIDは、PPIに依存しないビオチン化精度を向上させることが期待されています。
AirIDはプラントのPPI分析に理想的であると結論付けられました。
