ここに示すプロトコルは、3D培養用に最適化されており、3D環境におけるがん細胞の増殖、増殖、死に関連するプロセスの効率的かつ手頃な価格の調査を可能にしています。3D培養を使用する主な利点は、それらがインビトロで腫瘍微小環境の主要な側面を再現するためのユニークな可能性があるということです。3Dスフェロイドは、がん治療研究におけるインビトロとインビボ状態の間の翻訳を改善するためにますます使用されている癌薬スクリーニングのための重要なツールです。
プロトコルの中には、ある程度の練習とスキルが必要なものもあります。これは特に、手滴法によるスフェロイドの製造、免疫組織化学用のスフェロイドの埋め込みに当てはまります。これらの手順の重要な要素は、アガロースの一滴にスフェロイドを挿入する方法など、書面で記述することは困難であるとして、視覚的なデモンストレーションは、研究者がこれらの手順を実行するのに役立ちます。
調製した細胞懸濁液を15ミリリットルチューブで希釈し、最適な細胞密度を得る。希釈した細胞懸濁液を滅菌貯蔵所に移し、マルチチャネルピペットを使用して、以前に調製したプレートに200マイクロリットルを分配します。5%の二酸化炭素と95%の湿度で摂氏37度でインキュベート。
2~3日ごとに、スフェロイドの光顕微鏡画像を取得する。画像を取得した後、各ウェルから使用済み培地の100マイクロリットルを取り除き、100マイクロリットルの新鮮な媒体に置き換えます。まず、氷上の基質膜を解凍する。
使用前に、個別に包まれたプレートと貯水池を氷の上に保管してください。次に、調製した細胞懸濁液を15ミリリットルチューブで希釈し、最適な細胞密度を得る。希釈した細胞懸濁液を含むチューブを氷の上に置きます。
プラスチック容器に氷を充填し、ボンネットに移します。冷やしたプレートと貯留層を細胞培養フードに移します。プレートと貯水池を氷の上に戻します。
均質なゲルを確保するために、rBMを穏やかに再懸濁します。チルドセル懸濁液にrBMの最適濃度を加えます。チューブを反転して、rBMと細胞懸濁液が適切に混合されていることを確認します。
次に、この混合物を滅菌貯蔵所に移し、マルチチャネルピペットを使用して、200マイクロリットルを冷蔵、超低アタッチメント、96ウェルプレートの各ウェルに分配します。rBMが硬化したときに細胞が一緒にクラスター化されるように、750回gでプレートを15分間遠心分離します。遠心分離機ソフト降下または最小ブレーキ機能を使用してください。
まず、細胞培養皿に6ミリリットルのPBSを加えます。調製した細胞懸濁液を希釈して、適切な希釈液を得る。実用的な希釈は、ミリリットル当たり50,000細胞である。
細胞懸濁液を無菌貯留槽に注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して、細胞培養皿の蓋に最大30滴の懸濁液を慎重に入れ、1滴あたり2000個の細胞濃度を得る。迅速だが制御された動きでは、蓋を反転し、PBSを含む細胞培養皿の上に置きます。5%の二酸化炭素と95%の湿度で摂氏37度で4〜6日間インキュベートします。
スフェロイドをタンパク質のライゼまたは埋め込みに使用する場合は、蓋を取り除いて傾け、加熱された媒体を1ミリリットルで滴を洗い流して引っ張ります。得られたスフェロイド含有培地を1.5ミリリットルのチューブに移します。タンパク質のライゼートまたは埋め込みを進める前に、スフェロイドをチューブの底に落ち着かせてください。
P200ピペットチップの端部を切り取り、構造を乱すことなくスフェロイドをより簡単にキャプチャします。各条件について、1.5 ミリリットルチューブで 18 ~ 24 個のスフェロイドを最小 12 個引き上げるのが理想的です。チューブを氷の上に置き、回転楕円体を底に落ち着かせる。
次に、滅菌細胞実験室から通常の実験室に移ります。スフェロイドを氷冷1 X PBSの1ミリリットルで2回洗浄し、各洗浄ステップの間にPBSを取り除く前に回転楕円体を落ち着かせるようにします。その後、スフェロイドを乱したり除去したりすることなく、できるだけ多くのPBSを吸引する。
ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を用いて5マイクロリットルの加熱リシスバッファーをスフェロイド当たり添加します。回転楕円体を30秒間渦盛りし、10秒間素早い遠心分離を行います。これらの渦と遠心分離の間隔を5~10分間繰り返すか、回転楕円体が溶解するまで繰り返します。
PI溶液を調製した後、96ウェルプレートの各ウェルから100マイクロリットルの培地を取り除き、スフェロイドを取り除かないようにします。加熱された1つのX PBSを100マイクロリットルずつ各ウェルに加え、その後100マイクロリットルの液体を井戸から取り除きます。この洗浄工程を3回繰り返して、残りの培地を洗い流します。
次に、PI溶液を100マイクロリットルずつ各ウェルに加えます。プレートをアルミホイルで覆い、摂氏37度で5%の二酸化炭素と95%の湿度を10〜15分間インキュベートします。この後、前述のように1つのXPBSを加熱して洗浄工程を3回繰り返し、撮像時にPI溶液を洗い流し、バックグラウンド信号を減少させる。
蛍光顕微鏡を使用して、回転楕円体を画像化します。イメージングソフトウェア内で、マルチチャンネルメニューを開きます。関連するチャンネルの露出時間を設定し、各チャンネルを調整した後に[設定を読み取り]を押します。
Z スタック メニューを開き、イメージのフォーカスを調整して開始と終了を定義します。最初に回転楕円体が焦点を合わせなくなり、イメージが再びぼやけるまで、回転楕円体全体を通して焦点を移動します。次に、ステップサイズを18~35マイクロメートルに調整し、Startキーを押します。
まず、テキストプロトコルで概説されているように、1日目にヒュームフードで回転楕円体を固定します。2日目には、アガロースゲルを電子レンジの水で満たされたビーカーに入れ、加熱し、必要になるまで60度に設定されたベンチトップの加熱プレートでゲルを暖かく保ちます。1回の洗浄につき1ミリリットルの氷冷1 X PBSを使用して、ヒュームフードでスフェロイドを2回洗います。
その後、PBSの大部分を吸引する。20マイクロリットルのピペットチップを傾斜で切って準備し、より大きな穴を持つ尖った先端を得る。この後、顕微鏡スライド上にアガロースゲルドロップを作ります。
アガロースが固化するのを防ぐために、暖かい加熱ブロックの上にスライドを置きます。変更されたピペットチップを使用して、15〜20マイクロリットルの体積でできるだけ多くのスフェロイドをキャッチします。慎重にアガロースゲルドロップの中央にスフェロイドを注入し、顕微鏡スライドに触れないようにしてください。
アガロースゲルを硬化させるために、室温または4度で5〜10分間インキュベートします。ゲルドロップが幾分固まったが、まだ柔らかい場合は、メスを使用して顕微鏡スライドからプラスチック組織カセットに慎重に押し込みます。組織カセットをエタノールで満たされたビーカーに移し、室温で保管します。
本研究では、3D培養におけるがん細胞の生存率および死における抗癌治療による変化の分析のための一連の方法が提示される。rBMの濃度が添加され、スフェロイドの形態に大きな影響を与える可能性があります。最大2.5%rBMを添加すると、SKBr-3乳癌細胞におけるスフェロイド形成が可能であり、より高い濃度ではそれ以上の効果はない。
対照的に、BxPC-3膵臓癌細胞は、自然に小さなコンパクトなスフェロイドを形成する。この細胞型では、rBMを1.5%以上に増やすと、スフェロイドから突起や膣の突起を伴うより複雑な構造への明確な形態変化が引き起こる。化学療法効果のスクリーニングのためのスフェロイド培養の使用例をここに示す。
MDA-MB-231乳癌細胞における生存率の50%減少に必要な用量を決定するために行われる用量応答実験の間に、光顕微鏡画像は2〜3日ごとに取得される。インヒビター濃度の増加に伴う死細胞の空間的配置は、PI染色を用いて可視化することができる。見られるように、対照スフェロイドは限られた壊死性、後期アポトーシスコアを示し、一方死んだ細胞は抑制剤の濃度が増加するにつれてスフェロイド全体に分布する。
ここに示すスフェロイド技術は、3Dの浸潤、移動、またはマイクロ泳動解析など、他の多くのアッセイに適用できます。また、線維芽細胞、アディポサイト、または免疫細胞との共培養にも適用可能であり、腫瘍微小環境における細胞相互作用に関する重要な情報を提供することができる。この技術の開発は、遺伝子発現、浸潤、治療支援など、がんの発症の多くの側面における腫瘍微小環境の役割を解明する上で非常に重要である。
