マイクロバブルを用いたヒト末梢血単核細胞サンプルからの浮遊選鉱ベースのT細胞の単離、活性化、および増殖(英語)

マイクロバブルの活性化および拡張プロトコルは、細胞治療の研究と製造における満たされていない主要なニーズに対応し、T細胞療法の持続性と有効性を向上させるため、重要です。Akadeumの浮力ベースのポジティブセレクション、活性化、および拡張技術は、活性化および拡張ワークフロー中の過剰刺激とその後のT細胞の消耗を制限します。まず、市販のPBMCを2.5ミリリットルの分離バッファー中で10〜8回3回インキュベートし、ビオチン化抗CD3抗体を使用します。

ピペッティングで成分を穏やかに混合し、室温で10分間インキュベートします。製造元の指示に従って、剥ぎ取ったアビジンマイクロバブルを0.5対1の比率で細胞に追加します。そして、市販のエンドオーバーエンドローテーターを使用して、室温で20RPMで10〜15分間混合します。

室温で5分間400gで遠心分離します。遠心分離後、ポジティブに選択された細胞は、剥ぎ取られたアビジンマイクロバブルとともに懸濁液の上部にあり、残りの非選択細胞はチューブの下部にある細胞ペレット中にあります。9インチのガラスピペットを使用して、バブルセル層の下の先端をチューブの底に挿入します。

細胞ペレットと清液を電動ピペットで吸引し、新しいチューブに移します。元のチューブに残ったバブルセル層を1ミリリットルの完全なT細胞培地に再懸濁します。室温で400gで5分間遠心分離し、純度と回収率の間接測定に使用します。

亜清および未選択細胞の遠心分離後、上清を吸引し、カウントする前にペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁した。自動セルカウンターを使用して、明視野顕微鏡で下清中の細胞をカウントし、テキスト原稿に記載されているように、バブルセル層に捕捉された細胞の数を決定します。結合した抗CD28除去アビジンとマイクロバブルを作成するには、市販のマイクロバブルにビオチン化抗CD28抗体を加え、エンドオーバーエンド回転を使用して最低2時間混合します。

調製した気泡細胞懸濁液に抗CD28結合連鎖球菌アビジンマイクロバブルを1.5対1の比率で添加する。エンドオーバーエンド回転を使用して15分間コンポーネントを混合します。次に、得られた細胞数に応じて、完全なT細胞培地、または別の所望の培地を用いて、総体積をミリリットル当たり200万細胞に調整する。

1ミリリットルの活性化細胞を24ウェルプレートに分配し、加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。24時間後、IL-2と可溶性抗CD3を加えて、0日目に播種した最初の細胞数を使用して計算したように、さらなる増殖を促します。細胞プレートを加湿した二酸化炭素インキュベーターに戻し、摂氏37度で一晩インキュベートします。

2日ごとに培地の半分を中清から取り除きます。それを新鮮で完全なT細胞培地と交換し、ミリリットルあたり50単位の濃度でIL-2を追加します。T細胞を週に2回カウントして、細胞密度を評価します。

細胞密度がミリリットルあたり10〜6セルの2倍、または10〜6セルの2.5倍を超える場合は、より大きな容器に移し、ミリリットルあたり5倍の10〜5セルに希釈します。上下にピペッティングして各ウェルの内容物を穏やかに混合します。マイクロバブルを含むウェルの内容物全体を取り除き、1.5ミリリットルのチューブに移します。

400マイクロリットルのカルシウムフリーおよびマグネシウムフリーのDPBSで各ウェルを洗浄し、溶液を1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、チューブを400gで室温で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを50マイクロリットルの分離バッファーに再懸濁した。

次に、活性化と枯渇のために50マイクロリットルの細胞懸濁液をそれぞれ25マイクロリットルに分割します。活性化および枯渇抗体染色カクテルで細胞を染色し、暗所で室温で10分間インキュベートします。1ミリリットルの分離バッファーを加え、穏やかに混合し、遠心分離機で余分な抗体を洗い流します。

上清を完全に吸引します。細胞ペレットを1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー分析用の適切な容器に移します。生存可能なT細胞数および導入遺伝子陽性T細胞の増加は、対照試料とマイクロバブル共刺激を受けた細胞との間に観察された。

エフェクター細胞集団の増加もマイクロバブルサンプルで観察されました。生存可能な活性化T細胞は、増加した早期活性化マーカーCD69、および中期から後期活性化マーカーCD25を発現する。枯渇マーカーPD1陽性細胞の総数と割合も、マイクロバブル共刺激を受けた細胞サンプルで有意に高かった。

マイクロバブルは攪拌せずに急速に表面に浮遊するため、正確な投与を確保するためには、マイクロバブルの適切な混合と分注が不可欠です。他の方法で頻繁に見られるより消耗したT細胞よりも高い活性を持つT細胞の大規模な集団の急速な成長を可能にすることによって、それがそうすることを完全に期待しています。