現在までに臨床的に検証されたキメラ抗原受容体T細胞イメージングプラットフォームはありません。ヨウ化ナトリウムシンポーターは、PETスキャンによってCar T細胞をイメージングするための高感度で臨床的に関連するレポーターです。NIS CAR T細胞のTLP PETイメージングは、研究者がインビボで注入された細胞を非侵襲的に追跡することを可能にし、CAR T細胞療法の有効性と毒性を予測する可能性を秘めています。
CAR T細胞の効率的なイメージングは、T細胞のトラフィッキングと拡大の評価を可能にし、限界を克服するための戦略の開発を可能にします。このプロトコルに記載された方法は単純であり、本研究で示されたもの以外の他のCAR構築物にも適用することができる。標準的な密度勾配技術を使用して、血液サンプルから末梢血単核球またはPBMCを単離することから始めます。
これを行うには、気泡形成を避けて、50ミリリットルの密度勾配分離チューブに15ミリリットルの密度勾配媒体を静かに加える。細胞トラップを回避するには、血液サンプルを2%FBSを含むPBSで1対1の体積比で希釈し、希釈した血液を密度勾配培地の上に穏やかに移し、2つの間の界面を壊すことなく。次いで、分離管を1で遠心分離し、室温で10分間Gを200倍にする。
上清を新鮮な50ミリリットルの円錐形チューブに集め、チューブを50ミリリットルマークまで充填して2%FBSを含むPBSで細胞を洗浄し、室温で8分間300倍Gでチューブを遠心分離する。ペレット化された細胞を2%FBSを含む50ミリリットルのPBSに再懸濁する前に上清を吸引する。ペレット化したPBMCsを2%FBSを含むPBS中に、1ミリリットル当たり10〜6個目の細胞に対して50倍の濃度に再懸濁する。
新鮮な50ミリリットルのチューブで洗浄を繰り返します。細胞数をカウントし、次いで、細胞懸濁液を室温で8分間、300倍Gで遠心分離する。T細胞単離のために、単離されたPBMCを14ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに移す。
次に、ネガティブセレクション磁気ビーズキットを使用して、PBMCをネガティブセレクション抗体カクテルに入れてT細胞単離を全自動セル分離器に挿入します。T細胞単離後、細胞を計数し、1ミリリットル当たり10~6個目の細胞を2倍の濃度でT細胞増殖培地又はTCMで培養した。次に、抗CD3/CD28ビーズを含むバイアルを旋回させて混合し、必要な量のビーズを滅菌1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットで取り出します。
洗浄のために、ビーズを1ミリリットルのTCMに再懸濁してから、チューブを磁石に1分間置き、上清を吸引する。磁石からチューブを取り外した後、洗浄ビーズを1ミリリットルのTCMに再懸濁し、洗浄を2回繰り返す。洗浄したビーズを1ミリリットルのTCMに再懸濁してT細胞培養物に移し、次いで、T細胞ビーズ懸濁液をTCMで1.0倍濃度に希釈して第6細胞1ミリリットル当たり10倍にし、組織培養処理した6ウェルプレートに移す。
ウェルプレートを摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートする。レンチウイルスの形質導入を進行させるには、凍結レンチウイルスをコーティングキメラ抗原受容体またはヨウ化ナトリウム-ヨウ化物シンポーターで摂氏4度で融解する。24〜48時間のT細胞刺激の後、T細胞を混合してクラスターを分解し、融解したばかりのレンチウイルスを5回の感染の多重度で細胞に加える。
形質導入T細胞を摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートする。インキュベーションの3日目、4日目、および5日目に、形質導入されたT細胞をカウントし、新鮮な予め加温したTCMを加えて、細胞濃度を1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の1.0倍に調整した。ピューロマイシン耐性遺伝子を有するNIS形質導入T細胞の場合、3日目、4日目、および5日目にピューロマイシン二塩酸塩1ミリリットルあたり1マイクログラムで細胞を処理する。
6日目に、T細胞クラスターを分解し、プレートを磁石上に1分間置くことによって形質導入されたT細胞から抗CD3/CD28ビーズを除去する。次いで、回収した細胞を1ミリリットル当たり10~6個目の細胞の1.0倍の濃度で培養物に戻す。50,000個の細胞を含むT細胞培養物のアリコートをフローバッファーで洗浄し、50マイクロリットルのフローバッファーで細胞を再懸濁する。
CAR発現を検出するために、T細胞を1マイクロリットルのヤギ抗マウス抗体で染色する。死んだ細胞を除外するには、0.3マイクロリットルのLIVE/DEAD Aquaを加えます。染色した細胞を室温で暗所でインキュベートする。
15分後、細胞を150マイクロリットルのフローバッファーで650倍Gで4°Cで3分間洗浄する。染色された細胞を固定および透過処理するには、細胞を100マイクロリットルの固定培地とともに摂氏4度で20分間インキュベートする。次いで、サポニンおよび遠心分離機などの細胞透過剤を含む100マイクロリットルの緩衝液で細胞を2回洗浄する。
洗浄後、透過処理した細胞を50マイクロリットルの透過処理バッファーに再懸濁する。次いで、0.3ナノグラムの抗ヒトETNL NIS抗体を添加し、摂氏4度でインキュベートする。1時間のインキュベーションの後、実証されているように150マイクロリットルのフローバッファーおよび遠心分離機を加えることによって細胞を洗浄する。
次いで、細胞を、2.5マイクロリットルの抗ウサギ二次抗体を含む50マイクロリットルのフローバッファーと共に、摂氏4度で30分間インキュベートする。実証したようにT細胞を洗浄した後、細胞を200マイクロリットルのフローバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーを行う。次に、細胞の形質導入効率を決定する。
8日目に、T細胞を300倍のGでカウントして4°Cで8分間スピンダウンしてから、細胞ペレットを1ミリリットルあたり10〜6細胞に対して10倍の濃度の凍結培地で再懸濁した。細胞懸濁液1ミリリットルを各標識クライオバイアルに移し、マイナス80°Cの冷凍庫で48時間保存する。48時間後、T細胞を液体窒素に移す。
PET/CTイメージング用にNIS陽性BCMA CAR T細胞を注射したマウスを、マウスの秤量と金属製の耳札の取り外しによって準備する。次いで、新たに調製したF18テトラフルオロホウ酸塩の9.25メガベクレルを尾静脈注射を介してマウスに静脈内注射する。45分の取り込み期間の後、麻酔マウスの静止PET画像を15分間取得し、続いて360度回転および180投影で5分間CT画像取得を行った。
この代表的な解析では、2つのウイルスをT細胞に共形質導入すると、NIS陽性BCMA CAR T細胞が生成され、そこでは細胞の90%以上がNIS陽性であった。0日から8日までのT細胞増殖動態の分析により、BCMA CARおよびNISの取り込みは、形質導入されていない細胞と比較してT細胞増殖に有意に影響を及ぼさないことが明らかになった。OPM-2のフローサイトメトリー分析において、レンチウイルスで形質導入された細胞は、ピューロマイシンで処理した際のGFP発現を表した。
BCMA陽性ルシフェラーゼ陽性OPM-2細胞を投与されたマウスを生物発光イメージングに供し、OPM-2細胞の生着を確認した。F18テトラフルオロホウ酸塩投与マウスのPET画像化は、様々な器官および骨髄におけるNIS陽性BCMA CAR T細胞分布を明らかにした。さらに、マウスから採取した骨髄細胞は、OPM-2細胞の生着およびNIS陽性BCMA CAR T細胞の骨髄への送達を示した。
注入されたCAR T細胞の高品質イメージングのためには、NIS CAR T細胞生成プロトコルの手順に従い、NIS陽性画分とCAR陽性画分の存在を確認することが重要です。
