私たちのプロトコルは、フローサイトメトリーなどの単一細胞遺伝子発現解析に適した葉のアポプラストで増殖した細菌集団を回収できる穏やかな植物接種および抽出方法を提供します。この方法は、サンプルを植物細胞の破片で著しく汚染することなく、アポプラストからかなりの量の細菌を抽出することを可能にする。アポプラスチック細菌回収のためのこの最適化された方法は、植物病原性細菌または有益なエンドサイトーシス細菌のいずれかを含む多数の植物細菌系に直接またはわずかな改変を加えて適用することができる。
手順を実演するのは、私たちの研究室の博士課程の学生であるニーブスロペスパガンです。まず、直径10センチのポットに、以前に水をやった1:3バーミキュライト植物基質ミックスを入れます。穴あき金属メッシュで鍋を覆い、輪ゴムを使用して金属メッシュを湿った土に調整します。
次に、濡れたつまようじで金属メッシュの穴にシロイヌナズナの種をまきます。鍋の中の離れた位置に3〜4個の種を置きます。高い相対湿度を維持するためにプラスチック製のドームで鍋を覆い、摂氏4度で72時間成層化のためにインキュベートします。
短日条件下でポットを植物成長室に移します。ポットのカバーを外すには、プラスチック製のドームを取り外します。種子が発芽したら、ピンセットを使用してほとんどの苗を取り除き、ポットの各位置に1本の苗を保ちます。
次に、ペトリ皿の底を濡れたペーパータオルで覆い、その上に豆の種を置くことによって、Phaseolus vulgaris豆の植物を準備します。シャーレをサージカルテープで密封し、摂氏28度で3〜4日間インキュベートします。発芽した種子を、湿った1:3バーミキュライト植物基質ミックスで満たされた直径10センチメートルのポットに移し、長日の設定下で植物成長チャンバーでインキュベートします。
目的のシュードモナス・シリンガエ株のグリセロールストックを摂氏マイナス80度から、適切な抗生物質を添加したLBプレートにストリークします。プレートを摂氏28度で40〜48時間インキュベートします。細菌バイオマスをこすり落とし、5ミリリットルの10ミリモル塩化マグネシウムに再懸濁します。
600ナノメートルで光学密度を測定し、10ミリモルの塩化マグネシウムを加えて0.1に調整します。10ミリモルの塩化マグネシウムで段階希釈を行い、1ミリリットルあたり10〜5番目のCFUの5倍の最終接種材料濃度を取得します。次に、シロイヌナズナ植物用に200ミリリットル、豆植物用に50ミリリットルの接種材料を準備します。
接種前に、界面活性剤Silwet L-77を最終濃度0.02%、シロイヌナズナ接種0.01%まで加えます。シロイヌナズナの浸潤は、X字状の木の棒を2本置いて鉢の上に置き、200ミリリットルの接種材料を入れた直径14センチのシャーレの上に鉢を下向きに置きます。豆葉接種の場合は、植物と接種材料を真空チャンバーに挿入し、接種材料を含む50ミリリットルの円錐形遠沈管に葉を導入します。
葉に浸透させるために30秒間500ミリバールのパルスを与えます。余分な接種材料を紙で排出し、計画を対応する成長室に戻します。接種から4日後、シロイヌナズナの地上部またはマメの葉を切り取り、針のない20ミリリットルの注射器に入れます。
豆の葉の場合は、葉をそれ自体に転がし、軸方向の面を外側に残します。ティッシュを覆うのに十分な量の蒸留水を追加します。次に、シリンジを保持しているプランジャーを直立位置に挿入し、すべての空気が先端近くになるまでバレルを軽くたたくことでシリンジ内の余分な空気と気泡を取り除き、空気を除去した後、シリンジバレルの先端をパラフィンフィルムで覆います。
次に、プランジャーを慎重に押して、組織が暗くなるまで陽圧を発生させます。次に、プランジャーを引いて負圧を発生させます。パラフィンフィルムとプランジャーをはがし、アポプラスト抽出菌を含む液を採取します。
シングルセル分析の場合は、蒸留水中の1.5%アガロース溶液を調製します。溶けたら、並べて置いた2つの顕微鏡スライドの間のスペースを埋めるのに十分な量を追加し、別のスライドを上に置きます。15分間運転させ、上部に置かれたスライドを慎重に取り外します。
ブレードを使用して、使用前にアガロースパッドを5ミリメートル×5ミリメートルの断片にカットします。平行して、1ミリメートルのアポプラスト抽出細菌を遠心分離する。ピペットを使用して上清を注意深く除去し、ペレットを20マイクロリットルの水に再懸濁して細胞を濃縮します。
濃縮細胞を2マイクロリットルの滴を0.17ミリメートルのカバースリップの上に置き、その滴をアガロースパッドで覆います。共焦点顕微鏡で細菌調製物を視覚化し、特定のレーザーを使用して緑色の蛍光細菌を識別します。明視野を使用してすべての細菌を特定し、両方のフィールドをマージします。
フローサイトメトリーによる分析を行うには、アポプラスト抽出された細菌懸濁液のアリコートを取ります。フローサイトメーターを使用して分析し、100, 000イベントを取得します。hrpL GFPの発現は、GFP蛍光によってモニターされる。
ドットプロットグラフは、集団内のGFP対細胞サイズの蛍光強度分布を示し、ヒストグラムはGFP対細胞数の蛍光強度を示します。hrpL ONパーセンテージは、hrpL OFFの対応するパーセンテージよりも高かった。 蛍光顕微鏡画像は、hrpLの発現に関連するGFPの不均一なレベルを示しています。
GFP蛍光が低いかまったくない細菌が観察されます。最適な結果を得るには、細菌の抽出ステップ中は、植物組織への損傷を避け、植物の細胞含有量による汚染を制限するために穏やかにしてください。得られた細菌サンプルは、その後の細菌ゲノムまたはトランスクリプトーム解析のための核酸抽出など、植物汚染を低減することが利点である他の目的に使用できます。
