この高スループットプロトコルは、細菌病原体シュードモナスシリンガエへの野生の受診からトマト苗の迅速なスクリーニングを可能にする。苗の洪水の試しは植物の成長時間および成長の部屋の必要性を最小にし、植物の急速な回転を可能にし、大きいサンプルサイズをテストすることを可能にする。このアッセイは、野生のアクセスや複雑な遺伝的背景を持つ他のラインで抵抗をスクリーニングするために使用することができる強力なツールです。
プロトコルは、2つのシュードモナスシリンゲ株の洪水接種のための特定の方向を提供します。しかし、汎用性があり、他の細菌病原体に対する宿主抵抗性を検出するように変更することができます。この手順を実証することは、私の研究室の研究スペシャリストであるヤナ・ハサンです。
トマトの苗を育てることから始めます。トマトの種を2.2ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れ、50%漂白液を2ミリリットル加えます。チューブを25分間揺らし、ピペットで漂白剤溶液を取り除きます。
2ミリリットルの超純水を加え、チューブを5回反転して種子を洗います。チューブから液体を吸引し、さらに4回洗浄を繰り返す。最後の洗浄の後、2ミリリットルの超純水を加え、種子を無菌ペトリ皿に注ぎます。
鉗子をエタノールで焼き付けて殺菌し、5~7種の種子を0.5 XMSプラス0.8%の寒天培地で100×25ミリリットルのプレートに移します。外科テープでプレートの端を密封します。プレートが平らに積み重ねられ、上向きになっていることを確認します。
殺菌を同期させるために少なくとも3日間、暗闇の中で4°Cで殺菌された種子を成層させる。3日後、プレートの表面に沿って根が下に伸びるようにプレートを垂直方向に向け、シードの線が水平に向きます。16時間の光、8時間の暗いサイクルで摂氏22度に設定された成長室に種子を移します。
チャンバーで10日間苗を栽培し、その時点で彼らは通常、完全に出現し、拡大されたコチルドンと新興の最初の真の葉を表示します。平らな、無菌の爪楊枝を持つ適切なKB寒天に新鮮な細菌をストリーク。PstT1 の場合、洪水実験で細菌を使用する前に、48 時間摂氏 28 度でプレートをインキュベートします。
接種を調製するために、無菌で細菌を無菌に再懸濁し、10ミリモル塩化マグネシウムを0.1の光学密度とする。次に、2つの連続希釈液を作り、0075のOD600で作業濃度を得る。また、10ミリモル塩化マグネシウムで非イオン有機シリコーン界面活性剤共重合体の1〜10希釈を調製する。
それを渦巻き、細菌にそれを追加し、混合するチューブを渦巻きます。成長室から生安全キャビネットに10日齢の苗とプレートを移し、外科テープを取り外します。その後、各プレートに接種物の6ミリリットルを転送します。
ピペットチップで苗を接種器にそっと押し込み、タイマーを3分間開始します。各手に1つのプレートを保持し、苗のコチルドンと葉を水没させるためにプレートの前面を下に傾けます。接種側を5~7回横にスウィッシュし、プレートを戻して根を接種器で覆います。
プレートをもう一度傾け、サイクルを合計 3 分間繰り返します。プレートからイノキュラムを注ぎ、平らな表面に置き、残留接種を2度目に注ぎます。プレートを再ラップし、成長室に戻します。
マネーメーカーPtoRとマネーメーカー-PtoS品種は、PSTDC3000であふれ、洪水の7〜10日後にフェノタイプされました。マネーメーカー-PtoRの苗はPtoPRF遺伝子クラスターを運び、PSTDC3000に耐性があった。PSTDC3000エフェクターAVRPtoまたはAVRPto-Bを認識できないほぼ等同性のマネーメーカー-PtoS苗は、洪水の7日以内にすぐに死亡した。
10日齢の苗木はPstT1であふれ、洪水の少なくとも10日後にフェノタイプされました。受けやすい受け入れの影響を受けやすい受け入れは死んでいて、茶色の尖端のメリステムを持ち、新しい成長を欠いていた。対照的に、耐性苗は、新しい緑色の成長の高レベルを表示し、PstT1で感染を生き残った。
細菌増殖アッセイは、PstT1耐性およびソラナムネオリチLA1329を定量的に確認するために実施した。耐性と感受性の高いLA1329との間の細菌増殖の1.7ログの違いがあり、耐性LA1329とMoneymaker-PtoSの間には1.6ログの違いがあり、これはフェロティピックの結果と相関していた。このアッセイを行う際に覚えておくべき最も重要なことは、プロトコル全体で無菌技術に細心の注意を払い、プレート上のすべての苗が完全に浸水していることを確認することです。
必ず、植物組織や細菌に感染し、適切な規制に従って材料を処分してください。
