Unser Protokoll bietet eine schonende Pflanzeninokulations- und Extraktionsmethode, die die Rückgewinnung von Bakterienpopulationen ermöglicht, die im Blattapoplasten gezüchtet wurden und für die Einzelzell-Genexpressionsanalyse wie die Durchflusszytometrie geeignet sind. Diese Methode ermöglicht die Extraktion einer beträchtlichen Menge an Bakterien aus dem Apoplasten, ohne die Proben signifikant mit pflanzlichen Zelltrümmern zu kontaminieren. Diese optimierte Methode zur Rückgewinnung apoplastischer Bakterien kann direkt oder mit geringfügigen Modifikationen auf eine Reihe von pflanzlichen Bakteriensystemen angewendet werden, die entweder pflanzenpathogene Bakterien oder nützliche endozytäre Bakterien umfassen.
Das Verfahren wird von Nieves Lopez-Pagan, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Füllen Sie zunächst einen Topf mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern mit einer zuvor gewässerten 1:3-Vermiculit-Pflanzensubstratmischung. Decken Sie den Topf mit einem perforierten Metallgitter ab und passen Sie das Metallgitter mit einem Gummiband an den feuchten Boden an.
Als nächstes säen Sie Arabidopsis-Samen mit einem feuchten Zahnstocher in die Löcher des Metallgitters. Platzieren Sie drei bis vier Samen an entfernten Positionen im Topf. Decken Sie den Topf mit einer Kunststoffkuppel ab, um eine hohe relative Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, und inkubieren Sie ihn 72 Stunden lang bei vier Grad Celsius für die Schichtung.
Übertragen Sie den Topf unter Kurztagesbedingungen in eine Pflanzenwachstumskammer. Um den Topf freizulegen, entfernen Sie die Plastikkuppel. Sobald die Samen gekeimt sind, entfernen Sie mit der Pinzette die meisten Sämlinge und halten Sie einen Sämling in jeder der Positionen des Topfes.
Bereiten Sie dann Phaseolus vulgaris-Bohnenpflanzen vor, indem Sie den Boden einer Petrischale mit einem feuchten Stück Papiertuch abdecken und die Bohnensamen darauf legen. Verschließen Sie die Petrischale mit chirurgischem Klebeband und inkubieren Sie sie drei bis vier Tage lang bei 28 Grad Celsius. Übertragen Sie die gekeimten Samen in einen Topf mit einem Durchmesser von 10 cm, der mit einer feuchten 1:3-Vermiculit-Pflanzensubstratmischung gefüllt ist, und inkubieren Sie sie in einer Pflanzenwachstumskammer unter langen Tagen.
Streifen Sie den Glycerinvorrat des interessierenden Stammes Pseudomonas syringae von minus 80 Grad Celsius in eine LB-Platte, die mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt wird. Inkubieren Sie die Platte bei 28 Grad Celsius für 40 bis 48 Stunden. Die bakterielle Biomasse wird abgekratzt und in fünf Millilitern 10-millimolärem Magnesiumchlorid resuspendiert.
Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern und stellen Sie sie durch Zugabe von 10 Millimolar Magnesiumchlorid auf 0,1 ein. Führen Sie serielle Verdünnungen in 10-millimolaren Magnesiumchlorid durch, um eine endgültige Inokulumkonzentration von fünf mal 10 bis zur fünften KBE pro Milliliter zu erhalten. Bereiten Sie dann 200 Milliliter Inokulum für die Arabidopsis-Pflanzen und 50 Milliliter für die Bohnenpflanzen vor.
Vor der Inokulation wird das Tensid Silwet L-77 bis zu einer Endkonzentration von 0,02 % für die Bohnenimpfung und 0,01 % für Arabidopsis zugegeben. Legen Sie für die Arabidopsis-Infiltration zwei Holzstäbchen, die ein X bilden, über den Topf und stellen Sie den Topf mit der Vorderseite nach unten auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 14 Zentimetern, die 200 Milliliter Inokulum enthält. Für die Inokulation mit Bohnenblättern geben Sie die Pflanzen und die Inokulumlösung in eine Vakuumkammer und geben Sie das Blatt in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das das Inokulum enthält.
Geben Sie 30 Sekunden lang einen Impuls von 500 Millibar, um die Blätter zu infiltrieren. Lassen Sie die überschüssige Inokulumlösung mit einem Blatt Papier ab und geben Sie die Pläne in die entsprechende Wachstumskammer zurück. Schneiden Sie vier Tage nach der Inokulation entweder den oberirdischen Teil der Arabidopsis-Pflanze oder das beimpfte Blatt von der Bohnenpflanze ab und geben Sie es ohne Nadel in eine 20-Milliliter-Spritze.
Rollen Sie bei Bohnenblättern das Blatt auf sich selbst und lassen Sie die abaxiale Fläche nach außen. Fügen Sie genügend Menge destilliertes Wasser hinzu, um das Gewebe zu bedecken. Führen Sie dann den Kolben ein, der die Spritze in aufrechter Position hält, und entfernen Sie die überschüssige Luft und die Luftblasen in der Spritze, indem Sie vorsichtig auf den Zylinder klopfen, bis sich die gesamte Luft in der Nähe der Spitze befindet, und bedecken Sie nach dem Entfernen der Luft die Spitze des Spritzenzylinders mit Paraffinfolie.
Drücken Sie nun vorsichtig auf den Kolben, um einen Überdruck zu erzeugen, bis das Gewebe dunkler wird. Ziehen Sie dann am Kolben, um Unterdruck zu erzeugen. Entfernen Sie den Paraffinfilm und den Kolben und sammeln Sie die Flüssigkeit, die die mit dem Apoplast extrahierten Bakterien enthält.
Für eine Einzelzellanalyse bereiten Sie eine 1,5%ige Agaroselösung in destilliertem Wasser vor. Fügen Sie nach dem Schmelzen genügend Volumen hinzu, um den Raum zwischen zwei nebeneinander angeordneten Objektträgern zu füllen, und legen Sie einen weiteren Objektträger darauf. Lassen Sie sie 15 Minuten lang fahren und entfernen Sie den oben platzierten Schieber vorsichtig.
Schneiden Sie das Agarosepad vor Gebrauch mit einer Klinge in fünf mal fünf Millimeter große Stücke. Zentrifugieren Sie parallel dazu einen Millimeter der Apoplast-extrahierten Bakterien. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in 20 Mikroliter Wasser, um die Zellen zu konzentrieren.
Geben Sie einen Zwei-Mikroliter-Tropfen der konzentrierten Zellen auf ein 0,17-Millimeter-Deckglas und bedecken Sie den Tropfen mit einem Stück Agarosepad. Visualisieren Sie das bakterielle Präparat unter dem konfokalen Mikroskop, um grün fluoreszierende Bakterien mit spezifischen Lasern zu identifizieren. Identifizieren Sie alle Bakterien mit dem Hellfeld und führen Sie beide Felder zusammen.
Um eine Analyse durch Durchflusszytometrie durchzuführen, nehmen Sie ein Aliquot der Apoplast-extrahierten Bakteriensuspensionen. Analysieren Sie mit dem Durchflusszytometer und erfassen Sie 100.000 Ereignisse. Die Expression von hrpL GFP wird durch GFP-Fluoreszenz überwacht.
Die Dot-Plot-Diagramme zeigen die Fluoreszenzintensitätsverteilung von GFP im Vergleich zur Zellgröße in der Population, während die Histogramme die Fluoreszenzintensität von GFP im Vergleich zur Zellzahl zeigen. Die hrpL-ON-Prozentsätze waren höher als die entsprechenden Prozentsätze von hrpL-OFF. Fluoreszenzmikroskopie-Bilder zeigen heterogene GFP-Spiegel, die mit der Expression von hrpL assoziiert sind.
Es werden Bakterien beobachtet, die eine geringe oder keine GFP-Fluoreszenz aufweisen. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten Sie bei der Bakterienextraktion vorsichtig vorgehen, um eine Schädigung des Pflanzengewebes zu vermeiden und so die Kontamination durch den Zellinhalt der Pflanzen zu begrenzen. Die gewonnenen Bakterienproben können für andere Zwecke verwendet werden, bei denen die Verringerung der Pflanzenkontamination von Vorteil ist, wie z. B. Nukleinsäureextraktionen für die anschließende bakterielle Genom- oder Transkriptomanalyse.
