يوفر بروتوكولنا طريقة لطيفة لتلقيح واستخراج النباتات تسمح باستعادة المجموعات البكتيرية المزروعة في أبوبلاست الأوراق المناسبة لتحليل التعبير الجيني أحادي الخلية مثل قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة باستخراج كمية كبيرة من البكتيريا من apoplast دون تلويث العينات بشكل كبير بالحطام الخلوي للنبات. يمكن تطبيق هذه الطريقة المثلى لاستعادة البكتيريا apoplastic مباشرة أو مع تعديلات طفيفة على عدد من الأنظمة البكتيرية النباتية التي تضم إما البكتيريا المسببة للأمراض النباتية أو البكتيريا الداخلية المفيدة.
سيكون عرض الإجراء نيفيس لوبيز باغان ، طالب دكتوراه من مختبرنا. للبدء ، املأ أصيصا بقطر 10 سم بمزيج ركيزة نبات الفيرميكوليت 1: 3 الذي تم تسويته مسبقا. غطي الوعاء بشبكة معدنية مثقبة واضبط الشبكة المعدنية على التربة الرطبة باستخدام شريط مطاطي.
بعد ذلك ، زرع بذور Arabidopsis في ثقوب الشبكة المعدنية باستخدام مسواك مبلل. ضع ثلاث إلى أربع بذور في مواضع بعيدة داخل الأصيص. غطي الوعاء بقبة بلاستيكية للحفاظ على رطوبة نسبية عالية واحتضانه للتقسيم الطبقي عند أربع درجات مئوية لمدة 72 ساعة.
انقل الوعاء إلى غرفة نمو النبات في ظل ظروف يوم قصير. للكشف عن الوعاء ، قم بإزالة القبة البلاستيكية. بمجرد أن تنبت البذور ، استخدم الملقط لإزالة معظم الشتلات ، مع الاحتفاظ بشتلة واحدة في كل موضع من مواضع الوعاء.
ثم قم بإعداد نباتات الفاصوليا Phaseolus vulgaris عن طريق تغطية قاع طبق بتري بقطعة مبللة من منشفة ورقية ووضع بذور الفاصوليا فوقها. ختم طبق بتري بشريط جراحي واحتضانه عند 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. انقل البذور النابتة إلى وعاء قطره 10 سم مملوء بمزيج ركيزة نبات الفيرميكوليت الرطب 1: 3 واحتضانه في غرفة نمو النبات في ظل إعدادات يوم طويل.
قم بإخراج مخزون الجلسرين من سلالة Pseudomonas syringae ذات الأهمية من 80 درجة مئوية تحت الصفر في صفيحة LB مكملة بالمضادات الحيوية المناسبة. احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 40 إلى 48 ساعة. كشط الكتلة الحيوية البكتيرية وإعادة تعليقها في خمسة ملليلتر من كلوريد المغنيسيوم 10 ملليمولار.
قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر واضبطها على 0.1 بإضافة 10 مليمول من كلوريد المغنيسيوم. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية في كلوريد المغنيسيوم 10 مليمولار للحصول على تركيز لقاح نهائي يبلغ خمسة في 10 إلى CFU الخامس لكل ملليلتر. ثم قم بإعداد 200 ملليلتر من اللقاح لنباتات أرابيدوبسيس و 50 ملليلتر لنباتات الفاصوليا.
قبل التلقيح ، أضف الفاعل بالسطح Silwet L-77 إلى تركيز نهائي قدره 0.02٪ لتلقيح الفاصوليا و 0.01٪ ل Arabidopsis. لتسلل Arabidopsis ، ضع اثنين من العصي الخشبية لتشكيل X فوق القدر ووضع القدر متجها لأسفل فوق طبق بتري قطره 14 سم يحتوي على 200 مل من اللقاح. لتلقيح أوراق الفاصوليا ، أدخل النباتات ومحلول اللقاح في غرفة مفرغة وأدخل الورقة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على اللقاح.
أعط نبضة 500 مليبار لمدة 30 ثانية للتسلل إلى الأوراق. استنزاف محلول اللقاح الزائد بقطعة من الورق وأعد الخطط إلى غرفة النمو المقابلة لها. بعد أربعة أيام من التلقيح ، قم بقطع الجزء الجوي من نبات Arabidopsis أو الورقة الملقحة من نبات الفاصوليا ووضعها في حقنة سعة 20 مل بدون إبرة.
بالنسبة لأوراق الفاصوليا ، لف الورقة على نفسها ، تاركا الوجه المحوري للخارج. أضف كمية كافية من الماء المقطر لتغطية الأنسجة. بعد ذلك ، أدخل المكبس الذي يحمل المحقنة في وضع رأسي وقم بإزالة الهواء الزائد وفقاعات الهواء داخل المحقنة عن طريق النقر برفق على البرميل حتى يقع كل الهواء بالقرب من الطرف ، وبعد إزالة الهواء ، قم بتغطية طرف برميل المحقنة بفيلم البارافين.
الآن اضغط بعناية على المكبس لتوليد ضغط إيجابي حتى يصبح النسيج أغمق. ثم اسحب المكبس لتوليد ضغط سلبي. قم بإزالة فيلم البارافين والمكبس واجمع السائل الذي يحتوي على البكتيريا المستخرجة من أبوبلاست.
لتحليل خلية واحدة ، قم بإعداد محلول أغاروز 1.5٪ في الماء المقطر. بمجرد الذوبان ، أضف حجما كافيا لملء الفراغ بين شريحتين مجهريتين موضوعتين جنبا إلى جنب وضع شريحة أخرى في الأعلى. دعهم يقودون لمدة 15 دقيقة وأزل الشريحة الموضوعة في الأعلى بعناية.
باستخدام شفرة ، قم بقطع وسادة الأغاروز إلى قطع خمسة ملليمترات في خمسة ملليمترات قبل الاستخدام. بالتوازي ، أجهزة الطرد المركزي ملليمتر واحد من البكتيريا المستخرجة من apoplast. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولترا من الماء لتركيز الخلايا.
ضع قطرة من الخلايا المركزة بحجم ميكرولتر على غطاء 0.17 ملم وقم بتغطية القطرة بقطعة من وسادة الأغاروز. تصور التحضير البكتيري تحت المجهر متحد البؤر لتحديد البكتيريا الفلورية الخضراء باستخدام ليزر معين. تحديد جميع البكتيريا باستخدام المجال الساطع ودمج كلا الحقلين.
لإجراء التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي ، خذ حصة من معلقات البكتيريا المستخرجة من apoplast. تحليل باستخدام مقياس التدفق الخلوي والحصول على 100،000 الأحداث. يتم مراقبة التعبير عن HRPL GFP بواسطة مضان GFP.
تظهر الرسوم البيانية للرسم النقطي توزيع شدة التألق ل GFP مقابل حجم الخلية في السكان ، بينما تظهر الرسوم البيانية شدة مضان GFP مقابل عدد الخلايا. كانت النسب المئوية ل hrpL ON أعلى من النسب المئوية المقابلة ل hrpL OFF. تظهر صور الفحص المجهري الفلوري مستويات غير متجانسة من GFP المرتبطة بالتعبير عن hrpL.
لوحظت البكتيريا التي تظهر مضان GFP منخفض أو معدوم. للحصول على أفضل النتائج ، كن لطيفا أثناء خطوات استخراج البكتيريا لتجنب إتلاف الأنسجة النباتية وبالتالي الحد من التلوث من المحتوى الخلوي للنبات. يمكن استخدام عينات البكتيريا التي تم الحصول عليها لأغراض أخرى حيث يكون الحد من تلوث النبات ميزة ، مثل استخراج الحمض النووي للتحليل الجيني البكتيري أو النسخي اللاحق.
