X染色体異常を有する雌の卵巣細胞のFISH分析は、この特定のグループの卵巣細胞のX染色体含有量に関する洞察を得るためのユニークな技術です。これらの技術は、X染色体異常のある女性の生殖能力についてさらに学ぶのに役立つ可能性があります。どちらの方法も将来の研究を容易にすることを目的としており、臨床診療における診断ツールとして使用するようには設計されていないことに言及することが重要です。
手順を実演するのは、私たちの不妊治療研究所の上級研究員であるロナルドピークと、私たちの病理学部門のアナリストであるミラドインテザールです。まず、凍結保存または解凍した卵巣皮質組織をメスを使用して1つずつ1ミリメートルずつ細かく切ります。組織片を4リットルの予熱したL15で摂氏37度で75分間酵素的に消化します。
消化混合物を15分ごとに上下にピペットで入れます。10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した4ミリリットルの冷たいL15を加えて、酵素消化を停止します。解離した組織を500 gの遠心分離により8ミリリットルの冷たいL15培地で1回洗浄してから、500マイクロリットルのL15培地に再懸濁します。
主に個々の間質細胞および小卵胞を含む細胞懸濁液をプラスチック製のシャーレに移し、実体顕微鏡下で懸濁液を調べる。75マイクロメートルのプラスチックピペットを使用して手動で50マイクロメートル未満の卵胞をピックし、摂氏4度で10%FBSを添加したL15培地の液滴に移します。次に、精製した卵胞を0.06%トリプシン、1ミリリットルEDTAあたり1ミリグラム、および1ミリリットルグルコースあたり1ミリグラムの溶液に移し、摂氏37度で20分間インキュベートします。
インキュベーション後、75マイクロメートルのプラスチックピペットを使用して皮質細胞懸濁液から卵巣間質細胞を得る。蛍光In situハイブリダイゼーション、または個々の卵巣細胞のFISH分析の場合、トリプシン/EDTA/グルコースまたは間質細胞で処理した卵巣卵胞を、5マイクロリットルの0.15ミリモル塩化カリウムと15マイクロリットルのDPBSの液滴にスライド上に移し、摂氏37度で20分間インキュベートします。スライドを300マイクロリットルの0.05ミリモル塩化カリウム、7.5%酢酸、および22.5%メタノールで2分間乾燥させ、事前に固定します。
スライドを3対1のメタノール酢酸で2分間覆い、固定を確定します。固定後、調製したてのSSCでサンプルを摂氏73度で2回洗浄します。100マイクロリットルの2%プロテイナーゼKで覆い、カバースリップで密封します。
ハイブリダイゼーションステーションで摂氏37度で10分間スライドをインキュベートします。インキュベーション後、カバースリップを取り外し、振とうしながら室温でDPBSでスライドを5分間洗浄します。サンプルを1%ホルムアルデヒドで5分間固定します。
次に、スライドをDPBSで洗浄し、エタノール濃度を上げながらそれぞれ2分間連続脱水します。サンプルを風乾してから、蛍光標識プローブとハイブリダイズします。次に、1マイクロリットルのCEPX、1マイクロリットルのCEP18、および18マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーをサンプルに加え、スライドに接着されたカバースリップで密封します。
スライドをハイブリダイゼーションステーションに移して摂氏73度で3分間変性させた後、摂氏37度で一晩インキュベーションしながらハイブリダイゼーションを行います。ハイブリダイゼーション後、カバースリップと残っている接着剤をスライドから取り除きます。スライドを0.4X SSC、0.3%トゥイーン-20、摂氏72度で2分間洗浄した後、2X SSCおよび0.1%トゥイーン-20で1分間インキュベートします。
示されているようにスライドを脱水し、暗所で風乾してから、DAPIを含む封入剤で覆います。スライドをマイナス20°Cで10分間置いてから、蛍光顕微鏡で分析します。パラフィン切片をハイブリダイズするには、パラフィンリボンから卵胞を含む切片の前または後に新しい切片を選択します。
スライドガラスに1つのセクションを取り付け、摂氏56度のストーブで45分間乾燥させます。切片をキシレンで10分間脱パラフィンし、次にスライドを99.5%エタノールに浸し、水道水で5分間すすぎます。スライドをターゲット検索溶液で摂氏96度で10分間前処理します。
冷却後、スライドを蒸留水ですすいでください。スライドを0.01モルの塩酸で5分間処理した後、摂氏37度で15分間ペプシン消化します。スライドを塩酸で再度すすぎ、続いてPBSですすいでください。
スライドを1%ホルムアルデヒドPBSで5分間固定します。次に、スライドをPBSで簡単にすすぎ、再び脱塩水で洗い流してから、99.5%エタノールで脱水します。前処理されたスライドに5マイクロリットルのプローブCEP18とCEPXを適用します。
次に、カバースリップを適用し、写真のりで領域をシールします。スライドをハイブリダイザーに入れて、摂氏80度で10分間変性し、摂氏37度で一晩ハイブリダイゼーションを行います。翌日、スライドを摂氏42度のSSCでそれぞれ5分間2回すすぎ、続いて摂氏73度の0.3%ノニデットP-40で2分と1分間すすぎます。
再度、スライドを2X SSCですすぎ、蒸留水ですすぎ、99.5%エタノールで脱水します。スライドを風乾し、DAPI含有封入剤に取り付けます。患者Aの凍結保存された卵巣皮質組織は、リンパ球の50%が45、X核型、50%が46、患者B XX.In リンパ球の38%が45、X、28%が46、XX、34%が47、XXであった。
周囲の間質細胞もX染色体含量について分析した。卵巣皮質組織の酵素消化は、大部分が解離した細胞の懸濁液をもたらしたが、顆粒細胞の単層に囲まれた無傷の卵母細胞からなる原始卵胞を残した。小さな卵胞は、顆粒症細胞の凝集のために、FISH後のシグナルの解釈を困難にしました。
FISHの前にトリプシンで卵胞をさらに消化すると、個々の顆粒症細胞が卵胞の表面で球形の形態に収縮しました。ヘマトキシリンエオジン染色は、異種移植の5ヶ月後に卵巣皮質組織において形態学的に正常な二次卵胞および胞状卵胞を示した。これらの卵胞の顆粒化細胞のX染色体含量をFISH分析により測定した。
移植された卵巣皮質組織をブアン溶液に固定すると、緑色のもやのために濾胞細胞の蛍光シグナルがぼやけ、ほとんど不明瞭になりました。対照的に、ホルムアルデヒドで固定された卵巣皮質組織は優れた蛍光シグナルを提供しました。このプロトコルの主な課題は、卵巣細胞の単離と組織の酵素消化にあります。
このプロトコルから逸脱すると、プロセス中に卵巣細胞が大幅に失われる可能性があり、これはすでに卵巣予備能が低い女性では特に避けるべきです。追加の遺伝子発現プロファイリングは、卵胞形成に対する異数性卵巣細胞の影響、ひいてはX染色体異常を有する女性における早期卵巣不全のプロセスについてさらに学ぶのに役立つ可能性がある。
