FISH-анализ клеток яичников у женщин с аберрациями Х-хромосомы является уникальным методом, позволяющим получить представление о содержании Х-хромосомы клеток яичников в этой конкретной группе. Эти методы могут быть полезны, чтобы узнать больше о репродуктивном потенциале у женщин с аберрациями Х-хромосомы. Важно отметить, что оба метода предназначены для облегчения будущих исследований и не предназначены для использования в качестве диагностического инструмента в клинической практике.
Продемонстрируют процедуру Рональд Пик, старший научный сотрудник нашей лаборатории фертильности, и Милад Интезар, аналитик из нашего отделения патологии. Для начала разрежьте криоконсервированную или размороженную ткань коры яичника на мелкие кусочки один за другим на миллиметр с помощью скальпеля. Ферментативно переваривают фрагменты тканей в четырех литрах предварительно подогретого L15 в течение 75 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Пипеткой наносите смесь для разложения вверх и вниз каждые 15 минут. Остановите ферментативное пищеварение, добавив четыре миллилитра холодного L15 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки или FBS. Промойте диссоциированную ткань один раз восемью миллилитрами холодной среды L15 путем центрифугирования в 500 г перед повторной суспендированием в 500 микролитрах среды L15.
Перенесите клеточную суспензию, содержащую в основном отдельные стромальные клетки и мелкие фолликулы, в пластиковую чашку Петри и исследуйте суспензию под стереомикроскопом. Соберите фолликулы размером менее 50 микрометров вручную с помощью пластиковой пипетки размером 75 микрометров и перенесите их в каплю среды L15 с добавлением 10% FBS при четырех градусах Цельсия. Затем переведите очищенные фолликулы в раствор 0,06% трипсина, один миллиграмм на миллилитр ЭДТА и один миллиграмм на миллилитр глюкозы и инкубируйте в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия.
После инкубации получают стромальные клетки яичников из суспензии клеток коры головного мозга с помощью пластиковой пипетки размером 75 микрометров. Для флуоресцентной гибридизации in situ или анализа FISH отдельных клеток яичников перенесите обработанные фолликулы яичников трипсином/ЭДТА/глюкозой или стромальными клетками в капли по пять микролитров 0,15 миллимоляра хлорида калия и 15 микролитров DPBS на предметном стекле и инкубируйте в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия. Высушите и предварительно зафиксируйте предметное стекло в 300 микролитрах 0,05 миллимоляра хлорида калия, 7,5% уксусной кислоты и 22,5% метанола в течение двух минут.
Покройте предметное стекло метанольной уксусной кислотой в соотношении три к одному на две минуты, чтобы завершить фиксацию. После фиксации дважды промойте образец в свежеприготовленном SSC при температуре 73 градуса Цельсия. Накройте его 100 микролитрами 2%-ной протеиназы К и запечатайте крышкой.
Инкубируйте предметное стекло в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия на станции гибридизации. После инкубации снимите покровное стекло и промойте предметное стекло в течение пяти минут в DPBS при комнатной температуре при встряхивании. Зафиксируйте образец на пять минут 1%-ным формальдегидом.
Затем промойте предметное стекло в DPBS и последовательно обезвоживайте его, увеличивая концентрацию этанола в течение двух минут каждый. Высушите образец на воздухе перед его гибридизацией с флуоресцентно меченными зондами. Затем добавьте один микролитр CEPX, один микролитр CEP18 и 18 микролитров буфера гибридизации в образец и запечатайте покровным листом, который приклеивается к предметному стеклу.
Перенесите предметное стекло на станцию гибридизации для денатурации при температуре 73 градуса Цельсия в течение трех минут с последующей гибридизацией во время ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия. После гибридизации удалите покровное стекло и оставшийся клей со предметного стекла. Промойте предметное стекло в 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 при 72 градусах Цельсия в течение двух минут с последующей инкубацией в течение одной минуты в 2X SSC и 0,1% Tween-20.
Обезвоживайте предметное стекло, как показано на рисунке, и высушите его на воздухе в темноте, прежде чем покрыть монтажной средой, содержащей DAPI. Поместите предметное стекло при температуре минус 20 градусов Цельсия на 10 минут перед анализом с помощью флуоресцентной микроскопии. Чтобы гибридизировать парафиновые срезы, выберите новые срезы до или после срезов, содержащих фолликулы из парафиновой ленты.
Установите одну секцию на предметное стекло и сушите ее в течение 45 минут на плите при температуре 56 градусов по Цельсию. Депарафинизируйте срез в ксилоле в течение 10 минут, затем погрузите предметное стекло в 99,5% этанол и промойте его в течение пяти минут в водопроводной воде. Предварительно обработайте предметное стекло целевым поисковым раствором в течение 10 минут при температуре 96 градусов Цельсия.
После остывания промойте предметное стекло в дистиллированной воде. Обработайте предметное стекло в течение пяти минут 0,01 молярной соляной кислотой, а затем переваривайте пепсин в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Промойте предметное стекло еще раз в соляной кислоте, а затем в PBS.
Зафиксируйте слайд в 1%-ном формальдегиде PBS на пять минут. Затем ненадолго промойте предметное стекло в PBS и снова в деминерализованной воде, прежде чем обезвоживать его в 99,5% этаноле. Нанесите пять микролитров зонда CEP18 и CEPX на предварительно обработанное предметное стекло.
Затем нанесите покровное стекло и заклейте область фотоклеем. Поместите предметное стекло в гибридизатор для денатурации при 80 градусах Цельсия на 10 минут и гибридизации на ночь при 37 градусах Цельсия. На следующий день ополосните предметное стекло дважды в течение пяти минут каждое в SSC при 42 градусах Цельсия, а затем две минуты и одну минуту ополаскивайте в 0,3% Nonidet P-40 при 73 градусах Цельсия.
Опять же, промойте предметное стекло в 2X SSC с последующей промывкой в дистиллированной воде перед обезвоживанием 99,5% этанолом. Высушите слайд на воздухе и установите его в монтажную среду, содержащую DAPI. Криоконсервированная ткань коры яичников у пациента А показала 50% лимфоцитов, имели кариотип 45, X и 50% имели 46, XX.In пациентке Б, 38% лимфоцитов были 45, X, 28% были 46, XX и 34% были 47, XXX.
Окружающие стромальные клетки также были проанализированы на содержание Х-хромосомы. Ферментативное переваривание ткани коры яичников привело к суспензии в значительной степени диссоциированных клеток, но с оставлением примордиальных фолликулов, состоящих из неповрежденного ооцита, окруженного одним слоем клеток гранулеза. Небольшие фолликулы создавали трудности в интерпретации сигналов после FISH из-за слипания клеток гранулеза.
Дополнительное переваривание фолликулов трипсином перед FISH привело к тому, что отдельные клетки гранулеза сократились в сферическую морфологию на поверхности фолликулов. Окрашивание гематоксилин-эозином показало морфологически нормальные вторичные и антральные фолликулы в ткани коры яичников после пяти месяцев ксенотрансплантации. Содержание Х-хромосомы клеток гранулеза этих фолликулов определяли методом FISH-анализа.
Фиксация трансплантированной ткани коры яичников в растворе Буэна приводила к размытым и в значительной степени затемненным флуоресцентным сигналам в фолликулярных клетках из-за зеленой дымки. Напротив, ткань коры яичников, закрепленная формальдегидом, обеспечивала отличные флуоресцентные сигналы. Основная задача этого протокола заключается в выделении клеток яичников и ферментативном переваривании ткани.
Отклонение от этого протокола может привести к существенной потере клеток яичников во время процесса, и этого особенно следует избегать у женщин, которые уже имеют низкий овариальный резерв. Дополнительное профилирование экспрессии генов может быть полезно, чтобы узнать больше о влиянии анеуплоидных клеток яичников на фолликулогенез и, следовательно, на процесс преждевременной недостаточности яичников у женщин с аберрациями Х-хромосомы.
