X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücrelerinin FISH analizi, bu spesifik gruptaki yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriği hakkında fikir edinmek için benzersiz bir tekniktir. Bu teknikler, X kromozomal anormallikleri olan kadınlarda üreme potansiyeli hakkında daha fazla bilgi edinmek için yararlı olabilir. Her iki yöntemin de gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmayı amaçladığını ve klinik uygulamada bir teşhis aracı olarak kullanılmak üzere tasarlanmadığını belirtmek önemlidir.
Prosedürü gösteren, doğurganlık laboratuvarımızdan kıdemli bir araştırmacı olan Ronald Peek ve patoloji bölümümüzden bir analist olan Milad Intezar olacaktır. Başlamak için, kriyoprezerve edilmiş veya çözülmüş yumurtalık korteks dokusunu bir neşter kullanarak birer birer milimetrelik küçük parçalara ayırın. Doku parçalarını enzimatik olarak dört litre önceden ısıtılmış L15'te 37 santigrat derecede 75 dakika boyunca sindirin.
Sindirim karışımını her 15 dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin. % 10 Fetal Sığır Serumu veya FBS ile desteklenmiş dört mililitre soğuk L15 ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Ayrışmış dokuyu, 500 mikrolitre L15 ortamında tekrar askıya almadan önce 500 g'da santrifüjleme ile sekiz mililitre soğuk L15 ortamı ile bir kez yıkayın.
Büyük ölçüde bireysel stromal hücreler ve küçük foliküller içeren hücre süspansiyonunu plastik bir Petri kabına aktarın ve süspansiyonu stereo mikroskop altında inceleyin. 75 mikrometrelik plastik pipet kullanarak 50 mikrometreden küçük folikülleri manuel olarak seçin ve bunları dört santigrat derecede% 10 FBS ile desteklenen L15 ortamının damlacığına aktarın. Daha sonra saflaştırılmış folikülleri% 0.06 tripsin, mililitre EDTA başına bir miligram ve mililitre glikoz başına bir miligram çözeltisine aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, 75 mikrometrelik plastik pipet kullanarak korteks hücre süspansiyonundan yumurtalık stromal hücreleri elde edin. Floresan In Situ Hibridizasyon veya bireysel yumurtalık hücrelerinin FISH analizi için, tedavi edilen yumurtalık foliküllerini tripsin / EDTA / glikoz veya stromal hücrelerle beş mikrolitre 0.15 milimolar potasyum klorür damlacıklarına ve bir slayt üzerinde 15 mikrolitre DPBS damlacıklarına aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin. Slaydı iki dakika boyunca 300 mikrolitre 0.05 milimolar potasyum klorür,% 7.5 asetik asit ve% 22.5 metanol içinde kurutun ve önceden sabitleyin.
Fiksasyonu tamamlamak için slaytı iki dakika boyunca üçe bir metanol asetik asitle örtün. Sabitlemeden sonra, numuneyi 73 santigrat derecede taze hazırlanmış SSC'de iki kez yıkayın. 100 mikrolitre% 2 Proteinaz K ile örtün ve bir kapak kayması ile kapatın.
Slaydı hibridizasyon istasyonunda 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kapak fişini çıkarın ve slaydı DPBS'de beş dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalama altında yıkayın. Numuneyi% 1 formaldehit ile beş dakika sabitleyin.
Daha sonra slaydı DPBS'de yıkayın ve her biri iki dakika boyunca artan etanol konsantrasyonlarında seri olarak dehidrate edin. Numuneyi floresan olarak etiketlenmiş problarla hibridize etmeden önce havayla kurutun. Daha sonra, numuneye bir mikrolitre CEPX, bir mikrolitre CEP18 ve 18 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin ve slayta yapıştırılmış bir kapak kayması ile kapatın.
Slaytı üç dakika boyunca 73 santigrat derecede denatürasyon için hibridizasyon istasyonuna aktarın, ardından 37 santigrat derecede bir gece inkübasyonu sırasında hibridizasyon yapın. Hibridizasyondan sonra, kapak kaymasını ve kalan yapıştırıcıyı slayttan çıkarın. Slaydı iki dakika boyunca 0.4X SSC,% 0.3 Ara-20'de 72 santigrat derecede yıkayın, ardından 2X SSC'de bir dakika ve % 0.1 Ara-20'de bir dakika inkübasyon yapın.
Slaytı gösterildiği gibi kurutun ve DAPI içeren bir montaj ortamıyla kaplamadan önce karanlıkta havayla kurutun. Floresan mikroskobu ile analizden önce slaytı eksi 20 santigrat dereceye 10 dakika boyunca yerleştirin. Parafin kesitlerini melezleştirmek için, parafin şeridinden foliküller içeren bölümden önce veya sonra yeni bölümler seçin.
Bir bölümü bir cam slayta monte edin ve 56 santigrat derecede bir ocakta 45 dakika kurutun. Bölümü 10 dakika boyunca ksilen içinde paraffinize edin, ardından slaydı% 99.5 etanol içine batırın ve beş dakika boyunca musluk suyunda durulayın. Slaytı 96 santigrat derecede 10 dakika boyunca hedef alma çözeltisiyle ön işlemden geçirin.
Soğuduktan sonra, slaytı damıtılmış suda durulayın. Slaydı beş dakika boyunca 0.01 molar hidroklorik asitle tedavi edin, ardından 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca pepsin sindirimi izleyin. Slaydı tekrar hidroklorik asitte ve daha sonra PBS'de durulayın.
Slaydı beş dakika boyunca %1 formaldehit PBS'de sabitleyin. Daha sonra slaytı PBS'de ve tekrar demineralize suda% 99.5 etanol içinde dehidre etmeden önce kısa bir süre durulayın. Önceden işlenmiş slayta beş mikrolitre prob CEP18 ve CEPX uygulayın.
Ardından bir kapak fişi uygulayın ve alanı fotoğraf yapıştırıcı ile kapatın. Slaytı 10 dakika boyunca 80 santigrat derecede denatürasyon ve gece boyunca 37 santigrat derecede hibridizasyon için bir melezleştiriciye yerleştirin. Ertesi gün, slaytı SSC'de her biri beş dakika boyunca 42 santigrat derecede iki kez durulayın, ardından 73 santigrat derecede% 0.3 Nonidet P-40'ta iki dakika ve bir dakika durulayın.
Yine, slaytı 2X SSC'de durulayın, ardından% 99.5 etanol ile kurutmadan önce damıtılmış suda durulayın. Kızağı hava ile kurutun ve DAPI içeren montaj ortamına monte edin. Hasta A'da kriyokorunmuş over korteks dokusunda lenfositlerin %50'sinde lenfosit, %45'inde X, %50'sinde 46, Hasta B'de XX.In lenfositlerin %38'inde 45, X, %28'inde 46, XX ve %34'ünde 47, XXX saptandı.
Çevreleyen stromal hücreler de X kromozomal içeriği için analiz edildi. Yumurtalık korteks dokusunun enzimatik sindirimi, büyük ölçüde ayrışmış hücrelerin süspansiyonuna neden oldu, ancak tek bir granülazoz hücre tabakası ile çevrili sağlam bir oositten oluşan ilkel folikülleri bıraktı. Küçük foliküller, granülazis hücrelerinin kümelenmesi nedeniyle FISH sonrası sinyalleri yorumlamada zorluklar sağlamıştır.
FISH'ten önce foliküllerin tripsin ile ek sindirimi, bireysel granülazis hücrelerinin foliküllerin yüzeyinde küresel bir morfolojiye büzülmesine neden oldu. Hematoksilin eozin boyaması, beş aylık ksenogreftlemeden sonra over korteks dokusunda morfolojik olarak normal sekonder ve antral foliküller gösterdi. Bu foliküllerin granüloz hücrelerinin X kromozomal içeriği FISH analizi ile belirlendi.
Bouin çözeltisinde aşılanmış yumurtalık korteks dokusunun sabitlenmesi, yeşil bir pus nedeniyle foliküler hücrelerde bulanık ve büyük ölçüde gizlenmiş floresan sinyallerle sonuçlandı. Buna karşılık, formaldehit içine sabitlenmiş yumurtalık korteks dokusu mükemmel floresan sinyalleri sağladı. Bu protokolün ana zorluğu, yumurtalık hücrelerinin izolasyonunda ve dokunun enzimatik sindiriminde yatmaktadır.
Bu protokolden sapmak, işlem sırasında önemli miktarda yumurtalık hücresi kaybına neden olabilir ve bu, özellikle düşük yumurtalık rezervine sahip kadınlarda kaçınılmalıdır. Ek gen ekspresyon profillemesi, anöploid yumurtalık hücrelerinin folikülogenez üzerindeki etkisi ve dolayısıyla X kromozomal anormallikleri olan kadınlarda erken yumurtalık yetmezliği süreci hakkında daha fazla bilgi edinmek için yararlı olabilir.
