生体内での再生の研究には傷害モデルが不可欠ですが、腸管での再生を調べることは技術的な課題であることが証明されています。縦断的なイメージングプロトコルの欠如は、腸の再生を調整する細胞および組織スケールのダイナミクスへのより深い洞察を妨げてきました。このプロトコルでは、単一の陰窩スケールで組織損傷を局所的に誘発し、単一の陰窩またはより大きな腸場の光子ベースのレーザーアブレーション損傷に対する生きているマウスの腸上皮の再生応答を時間と空間制御された方法で追跡する生体内顕微鏡法について説明します。
その後の長期の反復的な生体内イメージングにより、損傷領域の経時的な追跡が可能になり、数週間にわたる組織回復中の陰窩ダイナミクスのモニタリングが可能になります。ひまわり油に溶解したタモキシフェンを手術の4〜6週間前に注射してマウスを誘導する。鎮痛剤を適用し、手術の30分前に200マイクロリットルのブプレノルフィンを皮下注射する。
手術の24時間前に飲料水にカルプロフェンを投与します。.オートクレーブ滅菌手術器具をバイオハザードキャビネットに導入します。加熱パッドの電源を入れ、温度を摂氏37度に設定します。
イメージングの少なくとも4時間前に顕微鏡の温度制御チャンバーの電源を入れます。気候室内の温度を摂氏37度で安定させます。2光子顕微鏡、スキャナー、レーザーの電源を入れます。
イメージングソフトウェアを起動します。レーザーの波長を960ナノメートルに調整し、シャッターを開きます。2〜3%イソフルランを使用してマウスを麻酔し、滅菌布で覆われた加熱パッドの上に置きます。
毎秒1回の呼吸の頻度と質を評価し、マウスの反射をチェックすることによって、麻酔の深さを確認します。マウスの目を目の軟膏で覆います。200マイクロリットルの予熱した滅菌生理食塩水を皮下注射します。
腹部を剃り、髪を取り除きます。手術部位の滅菌布を交換してください。直腸プローブを挿入して、マウスの温度を監視します。
気温は約摂氏37度になるはずです。新しい滅菌手袋を着用してください。消毒液を交互にスクラブした後、80%エタノールを3回使用して、円形に手術領域を洗浄します。
マウスを滅菌外科用ドレープで覆います。マウスの反射を確認してください。滅菌メスを使用して、皮膚を通して10ミリメートルの垂直正中線切開を行います。
ハサミを使用してリネアアルバを切開し、腹直筋を分離し、腹部を開きます。事前に温めた生理食塩水に浸した滅菌綿棒を使用してマウスの盲腸を見つけ、基準点として使用します。ガーゼに小さな切り込みを入れ、予熱した滅菌生理食塩水で濡らし、切開の上に置きます。
事前に温めた滅菌生理食塩水に浸した滅菌綿棒で腸を取り出します。滅菌した予熱生理食塩水を加えて腸を水分補給してください。マウスを予熱した滅菌イメージングボックスに移します。
滅菌ガラスの上に腸を置きます。マウスの頭をイメージングボックスの吸入チューブの中に置きます。必要に応じて、滅菌済みの可撓性フィルムとテープでマウスを固定します。
マウスが入っているイメージングボックスを顕微鏡チャンバーに入れます。15分ごとに直腸プローブを介して呼吸の頻度と深さ、および温度をチェックすることにより、イメージング中にマウスを監視します。イソフルランは1〜2%の間に保つ必要があります顕微鏡のIPを使用して腸内の領域を見つけます。
顕微鏡の内部カメラを使用して、関心領域の広い視野ビューを取得します。多光子顕微鏡の960ナノメートルレーザーを使用して関心領域を画像化します。実験で使用したフルオロフォームに応じてレーザー出力と波長を調整します。
この実施例において、陰窩発現膜は赤色蛍光タンパク質であり、かつタモキシフェンの低末端用量で誘導すると緑色蛍光タンパク質で確率的に標識される。関心領域の3ミクロンの10〜20ステップのZスタックを取得します。前にタイル画像から 1 つまたは複数の位置を選択します。
イメージングソフトウェアのブリーチポイントキャリブレーション機能を、ズーム32および124 x 124ピクセルの解像度でスキャン速度400ヘルツで、双方向スキャンプロパティを使用して3〜10秒間使用します。陰窩領域における損傷の開始は、緑および赤チャネルの両方における自家蛍光の増加によって認識され得る。アブレーション後、損傷部位のZスタックを取得して、損傷の場所と程度を確認します。
同じマウス内の複数の領域に対して前の 2 つの手順を繰り返します。麻酔下にあるマウスを滅菌縫合領域に置き、滅菌ドレープで覆います。予熱した滅菌生理食塩水に浸した滅菌綿棒を使用して、露出した腸を腹部に戻します。
吸収性縫合糸を用いて簡単な連続縫合を行うことにより、リネアアルバを縫合する。外科用結び目で縫合糸の四肢を閉じます。スキンレイヤーで同じ手順を繰り返します。
イソフルランステーションのスイッチを切り、イメージングボックスとインレーを洗浄して滅菌します。ケージを加熱パッドに1時間置いた状態で、マウスを手術から回復させます。術後6〜12時間で200マイクロリットルのブプレノルフィンを皮下注射します。.
術後72時間、飲料水にカルプロフェンを投与します。.マウスの体重を量り、手術後1週間毎日福祉を監視します。最初のイメージングセッションの少なくとも1週間後の2番目の時点で、手術と生体内イメージングを繰り返します。
血管のパターンを使用して、最初の時点で同じ関心領域画像を見つけます。マウスが別の時点で画像化されることを意図していない場合は、麻酔下で頸部脱臼を行うことによってマウスを犠牲にします。それ以外の場合は、手術部位の閉鎖と手術後のケアを続行します。
K19-Cre ERT mTmGマウスにタモキシフェンを注射して、手術および最初の画像セッションの4〜6週間前にGFPによる細胞の確率的標識を誘導した。マウスの腸を外科的に露光し、関心領域のカメラと蛍光画像を取得した後、多光子レーザーの破断点設定を使用して陰窩をアブレーションします。損傷の開始は、緑チャネルと赤チャネルの両方で自家蛍光の増加によって認識できます。
同じ手順が1か月後に繰り返され、血管系が同じ領域を見つけるための目印として使用されます。Lgr5-eGFP紙吹雪モデルを使用すると、さまざまな色でラベル付けされた陰窩を経時的に追跡して、回復のダイナミクスをマッピングできます。この例では、緑色の地下室はLgr5 Creを表し、マゼンタ色の地下室は紙吹雪の色でラベル付けされています。
レーザーアブレーションの2週間後に異なる再生モードが観察されます。一部の地域は変更されていませんが、他の領域は陰窩核分裂の形で改造を示すため、1つの地下室を2つに分割するか、融合、2つの地下室を1つにマージするか、陰窩の消失を示します。レーザーアブレーションと生体内顕微鏡法を組み合わせることで、定義された関心領域への損傷を制限します。
これにより、損傷の場所と損傷の程度を制御できます。損傷の重症度を調整して、陰窩または腸野全体を切除し、陰窩スケールでの再生反応について知らせることができます。空間制御に加えて、レーザーアブレーションは、同じマウスの恒常性と再生の両方の条件下で同じ臓器をイメージングすることに加えて、損傷の開始を正確に計ることを可能にし、それによって以前の損傷モデルの精度を上回ります。
レーザーアブレーションと反復生体内イメージングの応用は、再生、免疫学、および癌研究にまたがる多数の研究質問と多様な科学分野のプラットフォームとして利用できます。
