Name: isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging
Uploaded: 2014-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging at JoVE.com

We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut f&#252;r Molekulare und Zellul&#228;re Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).

注：このプロトコルはFAC選別によりのISCを隔離するために初めて使用されている場合は、次のコントロールは 、最初に適切にFACSパラメータを設定するためには必須です。野生型から解離細胞（ 例えば1118年 W）ショウジョウバエの中腸SYTOXなし。野生型（ 例えば1118ワット ）SYTOXとショウジョウバエの中腸から解離細胞（ステップ3.6を参照）。 SYTOXなしESG -Gal4、UAS-GFPフライラインの中腸から解離した細胞。 ガット郭清のためのソリューションと料理の作製<ol><li>各含む40の女性は、ESG -Gal4、UAS-GFPフライラインから飛ぶ4-6バイアルを準備します。 </li><li> 10×PBS原液から500ミリリットル1×PBS（1.8ミリモルのNaH 2 PO 4·H 2 O、8.4のNa 2 HPO 4·2H 2 O、175 mMのNaClを、pHを7.4に調整）を調製。 </li><li> 3.5を準備1×PBS中の％アガロース溶液（100ml 1×PBS中の3.5グラムの電気泳動グレードアガロース）。下部をカバーするためにペトリ皿（直径8.5センチメートル）にこのソリューションを注ぐことにより、解剖プレートを準備します。アガロース層は解剖手順の間に鉗子の先端の損傷を防ぎます。ゲルを4℃で解剖プレートを記憶固化した後。 </li><li>解剖前に、1×PBS + 1％BSAの300ミリリットル新鮮な準備をし、氷上または4℃でボトルを置く。 </li><li>遠心機の電源を入れ、4℃に冷却しましょう​​。 </li><li>エッジを滑らかにするために2ガラスパスツールピペットの先端を火炎。 </li><li>クリーン鉗子の二対の70％エタノールで1かみそりの刃。 </li><li>氷上で解剖中腸を収集するための4つの1.5ミリリットル〜6マイクロチューブを置きます。 </li></ol>中腸の消化管と解剖の調製<ol><li>標準フライベッドの上でCO 2を1バイアル（40ハエ）からハエを麻酔、すべての首を切るカミソリの刃を使用して解剖皿に転送飛ぶ。アガロースゲルを覆うように解剖皿に冷1×PBS / 1％BSA溶液を注ぐ。ハエがフロートします。 </li><li>鉗子の他のペアで胸部を保持しながら、鉗子の1対のフライ腹部をつかむ。腹部から胸部を分離する。腸が見え​​るようになりますし、前腸/クロップは、おそらくまだ胸部に接続されます。 </li><li>腸をつかみ、胸部から引き出します。腸を展開するには、作物をつかみ、少し離れて前方に腹部から腸を引っ張る。 </li><li> 1ピンセットや鉗子の他のペアとの前方に開いたキューティクルの縁部と腹部の後端をつかむ。突出した腸の組織を破壊しないように注意してください。キューティクルを破壊し、全体の腸が腹腔から引き出されるまで後方に非常に穏やかに引き続けるために離れて後方端を引き出します。それが収まるように大きすぎる場合、作物を事前に除去する必要がある体腔を通る。 </li><li>裸の中腸を離れる前腸、マルピーギ細管、後腸と卵巣を削除します。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いて、冷1×PBS / 1％BSA溶液を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに解剖中腸の一括転送し、チューブを氷上に維持する。サンプルは2時間以内に処理されなければならない。 </li><li>バッチ全体の解剖が完了した後、破片の上に左を洗い流すために、二重蒸留水で解剖ディッシュをすすぐ。 （ステップ2.1から2.7を繰り返します）中腸の次のバッチを解剖起動します。 3.1に進み、その後、2時間以内に、できるだけ多くのバッチを分析。 </li></ol> FACソートに収穫細胞へのガット組織の3消化<ol><li>中腸から1X PBS / 1％BSA溶液を除去し、各サンプルに0.5％トリプシン-EDTA溶液500μlを追加します。 </li><li> 20秒間よくボルテックスし、25〜30分間、室温で20 rpmで回転/穏やかに揺らしによってサンプルをインキュベートする。 </li><li>約30分後に再びボルテックスとチューブの底にそのまま中腸組織シンクをしてみましょう。注意深く新しい1.5 mlマイクロチューブにメッシュフレームドガラスパスツールピペットを用いて懸濁液中である細胞を除去し、35μmのナイロンを介してそれらをフィルタリングする。 </li><li> 4℃で5分間100×gで細胞をスピンダウン。ダイジェストを開始する際に注目すべきは、細胞ペレットは、最初は表示されない場合がありますが、ダイジェストが進む組織として見えるようになります。 <ol><li>慎重に残りの無傷の中腸組織を含むオリジナルサンプルチューブに戻ってトリプシン溶液を転送する。ペレットからあまりにも多くの細胞を転送することは避けてください。 </li><li>静かに冷たい1×PBS / 1％BSAを400μlの中で細胞ペレットを再懸濁。氷上で解離した細胞を含むマイクロ遠心チューブを保持し、光から細胞を保護するためにアルミホイルでチューブをカバーする。 </li><li>再び残りの無傷の中腸組織を含むトリプシン溶液をボルテックスし、サンプルを配置室温でさらに30分間ロッカー上に。 </li></ol></li><li>中腸組織のすべてが消化されるまで繰り返して、3.4.3に3.3を繰り返します。 1マイクロ遠心チューブにすべてのマイクロチューブから解離した細胞を結合します。結合されたすべての細胞懸濁液の体積を1.5mlを超えてもよいので、これは、3.4のように遠心分離工程を必要とし得る。氷の上に細胞懸濁液を維持し、光から細胞を保護する。 </li><li> 4℃で5分間100×gで分離した細胞をスピンダウン。慎重にマイクロ遠心管中で1×PBS / 1％BSA溶液を約50〜100μlのを残しできるだけ上清をできるだけ多く除去する。静かにSYTOX（20,000 1）を含む800μlの1×PBS / 1％BSA中で解離細胞を再懸濁。 </li><li>セルストレーナースナップキャップ（35μmのナイロンメッシュ）を通して細胞を濾過することによって5mlまで丸底ファルコンチューブに細胞懸濁液を移す。常に氷上で細胞サンプルを維持し、光から保護した。細胞は、今まで準備ができているソートする。 </li><li>細胞は、その後のRNA単離のためにソートされるその中にそれぞれのマイクロ遠心チューブにRNAlaterを液の600μlのピペット。他の下流のアプリケーションのための細胞を滅菌PBSで、例えば異なる溶液中に回収することができる。 </li></ol> FACソートは腸管幹細胞を単離する4. <ol><li>フローサイトメトリー機器上のスイッチのソートに少なくとも1時間前。流体システムは、気泡がないことを確認してください。 </li><li>シース流体の流れの中に細胞を注入するために70μmのノズルサイズを選択してください。 </li><li> （70μmのノズルを使用する場合、6-7）、ギャップ値が基準値に対応するように、コア流体の流れの振幅を調整する。コア流体の流れをソートするために開始する前に安定させます。 </li><li>最初にソートするためのパラメータを設定する際にこの順序に従ってください。 <ol><li>野生型gutsから得た解離した細胞をロードします。まず、FSCとSSCの電圧を調整散布図の中央のセルをプロットする。全ての細胞は、対数x軸に10 2の下方にプロットされているように、第2、FITC（GFP）の電圧を調整する。 FITCのパラメータを設定すると、自己蛍光のための制限を設定します。 </li><li>ロードSYTOXを有する野生型gutsから得た解離した細胞が追加されました。 FSC-散布図対パシフィックブルーで死んだ、SYTOX陽性細胞からパシフィックブルー電圧値とゲートを識別するために、独立したリビング細胞を調整します。 </li><li> SYTOXずにESG -Gal4、UAS-GFPフライラインから得られた解離した細胞をロードし、すべてのGFP陽性細胞が散布図内にプロットされることを保証するために、FITC電圧を調整する。 </li></ol></li><li> ESG -Gal4から得られた解離した細胞をロードして、SYTOXとUAS-GFPフライラインが追加されました。死んだ、SYTOX陽性細胞（ゲートP1）からパシフィックブルー電圧値とゲートを識別するために、独立したリビング細胞を調整します。 <ol><li> SSC-AとGFP-を識別するためのFSC-ゲートを設定します（ヒストグラムプロットに基づいて）陽性細胞のサイズおよび粒度（ゲートP2）により決定される。 </li><li>そのサイズ（ゲートP3）に基づいたGFP陽性細胞ダブレットを特定し、排除するためにFSC-HとFSC-Wゲートを設定します。 </li><li>彼らの粒度（ゲートP4）に基づいたGFP陽性細胞ダブレットを特定し、排除するためにSSC-HおよびSSC-Wゲートを設定します。 </li><li> GFP強度対細胞（カウント）の数を示しているヒストグラムプロットでGFP陽性細胞を描写するためにゲートP4を使用してください。 GFP陽性細胞の二つの明確なピークが見えるようになります。各ピーク（ゲートP5およびP6）用のゲートを作成します。ゲートP5はのISCのために濃縮され、ゲートP6内のセルとは別にソートすることができ、細胞集団が含まれています。 </li><li>等高線図におけるバックゲートは、2つの異なるGFP陽性細胞集団は生きた細胞（ゲートP1と比較）し、正しいサイズのセルを（ゲートP2と比較）が含まれていることを確認します。 </li></ol></li><li> 600＆＃が含まれている1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞を選別181;のRNAlater溶液のリットル。ソートは、低流量（最大2.0、70μmのノズル1000イベント/秒、70 psi）で双方向純度ソートを用いで行われる。 </li><li>ソートが完了した後、すぐにソートされた細胞を簡単にボルテックスし、RNA単離または他の下流のアプリケーションに進むまで氷上でマイクロ遠心チューブを保つ。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

提示プロトコルは、その後にそのような次世代シーケンシングのようなさらなる分子分析のために使用することができ、老若男女大人のショウジョウバエの中腸からのISCを分離する方法を説明している。 ESG -Gal4からのGFP陽性細胞集団のFACソーティングは、UAS-GFPフライラインは、既にいくつかのグループ21,22によって達成された。しかし、今までGFP陽性細胞の二つの別個のピークの存在はいずれか見落とさまたは過小評価されている。我々は、この分離は、細胞型（のISCとのEB）の2つの異なる集団を表していないだけでなく、GFP陽性細胞の2つのピークが老化中に明確に別個とどまることを示している。この観察結果は、関連性の高いと熟成中幹細胞または前駆細胞を研究に興味を持って研究者に貴重なものです。古い中腸からのISCの単離は、熟成中腸でのISCを同定するための分子的マーカーの組み合わせが存在しないという事実によって妨げられてきた。唯一のマーカーUnambiguouslyのISCは、中腸12,13で唯一の分裂細胞であるため、リン酸化histone3（PH3）である旧中腸内のISCを識別します。しかし、PH3は、任意の所与の時点で、幹の分裂細胞の数は、その後の分析のためのISCのまともな量を得るためには低すぎるのでのISCを単離するための不適当なマーカーである。フライラインESG -Gal4、UAS-GFPは、ISC機能、維持および分化を研究研究者によって使用される最も一般的なフライラインです。のISC恒常性の分子調節に関する我々の現在の知識は、特定の分子やシグナル伝達経路が操作されている中での研究に基づいています（7でレビュー）。したがって、我々はまだ高齢化中に発生する内因性分子の変化についての知識が不足している。本明細書中に記載される方法は、このギャップを閉じ、のISC老化中の任意の時点で、成体中腸からその大きさ、粒度及びGFP強度に基づいて単離することができるという事実に基づいている。 同時に私たちは信頼性のある結果のために重要であることが次のステップを発見したこの方法を確立し、最適化する。約200ガッツはFACのソートにのISCの良い量を得るために解剖される必要がある。解剖の速度は非常に重要であり、個々の練習に依存します。訓練を受けた個人は、20〜30分以内に40根性を分析することができます。 GFPはまた、ESG -Gal4でマルピーギ細管で表現されているので、UAS-GFPフライライン、それは完全に中腸からマルピーギ細管を除去することが不可欠である。解剖中腸組織の劣化を回避し、組織内のRNアーゼ活性を低下させるために涼しい環境に保持されなければならない。したがって、解剖中腸は20〜30分の最大後冷1×PBS / 1％BSA溶液を含むマイクロ遠心チューブに解剖皿に移し、氷上に保持しなければならない。しかし、解剖中腸をトリプシンで組織解離を開始する前に、以上の2時間氷上に放置してはならない。最もefficiENTアプローチはその後、これらの2時間内で可能なハエのような多くのバッチを分析トリプシンは、これらのバッチのためにダイジェストを開始することです。以上の中腸が必要な場合は、トリプシン消化物のインキュベーション時間の間に解剖することができる。 トリプシンは、非常に強力な酵素であり、細胞に有害な影響を与える可能性がありますが、我々はまだ、その後のFACのソートのための十分な生活、健康な細胞を得た。無傷の細胞の単離を可能にする我々の手順の重要なステップは、解離した細胞を、トリプシン溶液を30分毎から除去されることである。解剖中腸を室温で溶液を含むトリプシンで2½時間インキュベートされた場合、我々は死んだ、SYTOX陽性細胞が20〜30％の増加を観察した。これは、我々が使用するトリプシン溶液はEDTAが含まれていることが指摘されるべきである。 EDTAの存在は、おそらく、細胞外マトリックス分子の適切な機能に必要なカルシウムおよびマグネシウムイオンをキレート化することによって、組織の崩壊を促進する。 </P&gt; 老いも若きも根性から最も重要なステップを正常にソートのISCは、FACSと説明したコントロールを使用して、特定のソート階層を以下のゲーティングパラメータの適切な初期設定です。私たちは、ARIA IIフローサイトメーター（FACSDivaソフト）のソートFACを行った。それは、器具が前のレーザを暖めるために選別に少なくとも1時間になっていることが重要である。のISCのFACの仕分けを初めて行う際に注目すべきは、並べ替えのための補償のためのパラメータは、上記のコントロールを使用して設定する必要があります：（1）SYTOXを添加することなく、野生型からの細胞（ 例えば1118年 W）ショウジョウバエ中腸解離 - このパラメータ（ステップ4.4.1）を設定すると、彼らの自己蛍光に基づいて細胞を選別防ぐ。このパラメータを設定する- （2）SYTOXとショウジョウバエの中腸が追加（ 例えば1118ワット ）野生型から細胞を解離した（ステップ4.4.2）細胞（死細胞は、高い自己蛍光を有し、ソートGFP陽性細胞を汚染する可能性がある）生きているから死ん分離することができ。 （3）ESG -Gal4の中腸から細胞を解離し、SYTOXなしUAS-GFPフライライン-このパラメータを設定する（ステップ4.4.3）は、すべてのGFP陽性細胞が散布図内にプロットされることを保証します。これらのパラメータが正しく設定されていない場合は、ソートされた細胞集団は、おそらく、死細胞および残骸（ 図5B、C）が含まれ、多くのGFP陽性細胞（ 図5D）失われ、GFP陽性細胞のための2つの別個のピークとしてヒストグラムプロットで見られる（ 図2E及び図3E）は検出されません。 FACSおよびゲーティングパラメータが設定されたら、楽器を校正とのESG -GAL4、UAS-GFPフライラインから細胞を選別する準備ができている。これらのパラメータは保存することができますので、すべての将来は、ESG -GAL4、UAS-からのISCとEBSのセッションをソートGFPのフライラインは、ステップ4.5から開始することができます。 「純度」モードを選択し、双方向の純度を行うことがソートソートされた細胞の数を減少させるが、それは高いストリンジェンシーの選別（ステップ4.6および図4B、C）が可能になる。注目すべきは、死細胞を標識するためにSYTOXの代わりにヨウ化プロピジウムを使用する利点は、低スピルオーバーがスピルオーバーを補償することを容易にFITC（GFP）チャンネルに存在することである。 のISCとEBSの濃縮する我々の方法は、それぞれ、異なるGFP発現レベルに応じて細胞を選別に基づいています。それはmisdifferentiatedのEBエージング中にも低いレベルでGFPを発現するのISCと誤認される可能性があることがあります。ソートされた細胞はまた、大きさや粒度が異なっているのでしかし、我々は我々の仕分け戦略はのISCとEBを濃縮するために、この日付に最も適していると考えています。また、それは、ISCの同一性を保持するエージング中腸の細胞は小核を有することが知られている15。ソートされた細胞のアイデンティティについての詳細明瞭さを得るためには、ESG -GAL4、UAS-GFPとNotchシグナル伝達レポーター導入遺伝子を運ぶトランスジェニックフライラインから細胞を選別できた。ノッチのみのEB 12,13において活性であることが示されているので、のISCは、EBを、ノッチレポーターについて陽性になるのに対し、ノッチレポーターについて陰性であろう若い腸から単離された。しかし、高齢化Notchシグナルの間、中腸組織に異常になる。したがって、のISCとしたEBを区別するように設定この実験は確かに、より信頼性があるかどうかをテストする必要がある古い中腸から分離。 我々はすでに老いも若きも中腸からのISCの比較トランスクリプトーム解析のためにこのアプローチを採用し、高齢化の際に示差的に調節されている多くの要因を特定した（未発表。observ。）。さらに、この方法は、ISCにしたEBの間の遺伝子発現の差を分析することを可能にする。このような調査sは、細胞が分化過程に入ると、発生初期の分子的変化への洞察を提供するであろう。また、高齢化とその後の分析中のEBの分離は、加齢性misdifferentiationの分子変化に光を当てるします。さらに、この方法は、遺伝子機能を研究するために、ショウジョウバエで使用される他の遺伝子ツールと組み合わせることができる。要約すると、この方法では、高齢化の際に分子特性とのISCとEBの変化を調査するための公平なアプローチを提供しています。これは成人の幹細胞および前駆細胞の老化メカニズムの探査を促進する貴重なツールです。

古い成長の避けられない結果が機能しているために組織や臓器の減少能力です。成体幹細胞は、幹細胞はまた、それらの生物学的挙動の減少を経験し、年齢を生物がしかしとして、組織の恒常性および器官の機能を維持するために不可欠である。これは、腸上皮のような高い代謝率を有する組織、特に有害である。老化した幹細胞の顕著な特徴は、ゲノム損傷、障害修復機構、障害、細胞周期の調節及び（1-3で概説）正常な幹細胞の挙動に影響を与える全てが誤制御シグナル伝達経路が挙げられる。特定のシグナル伝達経路を操作するか、特定の遺伝子をノックダウンすることにより、我々は、調節および正常な幹細胞の挙動を維持における役割の洞察を得た。これらの実験のほとんどは、候補分子アプローチであるため、我々は、中に幹細胞で起こる内因性分子の変化についてほとんど知識を持っている高齢化。この問題にアプローチする一つの方法は、その発現プロファイル熟成中に著しく変化する分子を同定するために、古い幹細胞に対する若いのトランスクリプトームを比較することである。残念ながら、生物学的および技術的な課題は、これまでのところ、このアプローチに関する当社の進展を妨げている。 キイロショウジョウバエは、（4に概説される）の表現型を老化寿命が短い（約60〜70日）や展示があるので老化を研究するのに非常に適したモデル生物である。また、 ショウジョウバエの老化プロセスは、温度によって加速させることができる。 29℃でのハエを維持する場合、腸組織における高齢表現型は、既に15日5後に観察することができる。さらに、 ショウジョウバエは、遺伝子操作の過多のために適している。特に、 ショウジョウバエ中腸は異なるシグナル伝達経路とに環境問題の影響を研究するための優れたモデル系として浮上している（6-10に見直し）高齢化の際、腸管幹細胞（ISCS）の生物学。 ショウジョウバエ腸上皮は、高い離職率を有しており、男性の11で隔週女性で約月に一度更新されます。 ショウジョウバエの中腸内に存在するのISCは分裂と自己リニューアルISCとenteroblast（EB）12,13と呼ばれる有糸分裂後前駆細胞を生成する能力を有する。 EBは、吸収腸細胞または分泌腸内分泌細胞のどちらかに分化する。今日まで、明確にISCをラベルのみマーカーの組み合わせは、転写因子エスカルゴ（ESG）およびNotchリガンドデルタにD1 14の表現である。しかし、これは若くて健康腸にも当てはまる。高齢化の際、中腸上皮はISC増殖15-17の増加によって特徴づけられる。さらに、異常なNotchシグナル伝達は、ISCの娘細胞の運命決定を破壊としたEB 15のmisdifferentiationを誘導する。これにより、経年腸内真正幹細胞を同定するには不十分のDI表現をレンダリングする、Notchシグナルと共発現ESGとのDIに対して活性である細胞の蓄積をもたらす。真のISCを特定することが困難で、今まで高齢化のISCにおいて内因性の変化を検討する能力を妨げています。 私たちは、のISCとEBにおけるGFP発現のレベルは本質的に異なるものであり、高齢化を通じて別のままであるESG -Gal4、UAS-GFPトランスジェニックフライラインを利用することによって、この問題に取り組んしている。同様のアプローチは、幼虫の神経芽細胞およびニューロン18,19の単離のために記載されている。老いも若きも、ESG -Gal4、UAS-GFPハエの中腸を切開し、単一細胞に解離させた。次いで、細胞を、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）を使用して、GFP陽性細胞を選別した。興味深いことに、ソートされたGFP陽性Cのエルは、GFPの蛍光強度（GFPおよびGFP 高い低 ）に基づいて2つの別個のピークに分配。さらに、また、セルサイズと相関つのピークにおけるGFP陽性細胞の分布：低いGFP強度を示した細胞は小さく、高いGFP強度を有する細胞に対し、より少ない粒状大きく、より粒状であった。この観察は、小さいのISCは、GFP強度に基づいて、FACSを使用して、適切な前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）の設定を選択する大きなEBから区別することができることを示唆した。興味深いことに、2つのピークがはっきりと老化中に分離されたままであった。また、2つのピークの比は、エージング中腸の上記の特徴を反映した形で変更：大の数は、時間をかけてEBを増大するmisdifferentiatedすなわちこと。これらの知見から、我々は適切なFACSパラメータ設定を使用して、GFP陽性細胞を選別することによって、我々は任意の時刻dでのISCとのEBを濃縮することができると結論uring高齢化。 要約すると、我々はあらゆる年齢のショウジョウバエの中腸から、2つの異なる細胞集団、のISCとEBSの充実や、次世代シーケンシングなどのさらなる分析のためにこれらの細胞を単離する研究者を可能にし、FACS戦略を紹介する。この強力な方法は、幹細胞又は前駆細胞の濃縮集団で高齢化に固有の内因性の分子機構を研究することができます。これらの研究から得られたデータは、間違いなく種間老化重要である保存された分子の同定を容易にする。

<table><tbody><tr><td>Forceps: Dumont, Inox Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>SefarNitex 03-150um/38 (35 &amp;micro;m nylon mesh)</td><td>Sefar</td><td>3A03-0150-102-00</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td>543-42210-00</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.</td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>Life Technologies</td><td>AM7023</td><td>Other solutions, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Trizol can be used for subsequent RNA isolation</td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Turn on one hour prior to sorting</td></tr></tbody></table>

isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

FACの仕分けから50,000〜100,000細胞間で取得するには、160〜200中腸を切開する必要がある。これは明らかに全体の手順の中で最も時間のかかるステップです。 図1Aに示した漫画は、ここで提供されたプロトコルに詳細に記載されている腸切開の主要なステップを示す。この手順は、個別に変更することができる。解剖し、全消化管は、 図1Bに示されている。 中腸組織のすべてが消化されたときは、すぐにFACの仕分けを続行。プロトコルに記載のゲーティング戦略に続いて成功した同定を可能にし、若い（ 図2）から、古い中腸（ 図3）からのISCのためにとEBSの濃縮された細胞集団の選別。 P1のゲートのみ健康生細胞と死細胞をゲートアウトするために含まれるように設定されている。対数Y-AXで10 3上記の細胞プロットパシフィックブルーチャネルを使用する場合では、死細胞として定義される。したがって、ほとんど破片であり、x軸（FSC-A）40下のプロットの点も（ 図2A）は除外される。 FSC-A対SSC-Aの散布図では細胞は、その大きさや粒度に基づいて配布されます。光電子増倍管（PMT）の電圧を調整することにより、 図2Bに示すように、最適な解決のために、細胞は散布図内に配置されている。 SSC-W対FSC-WとSSC-H対散布図FSC-H、単一の細胞が（ 図2C）サイズに基づいて凝集体および二重線から分離され、粒度（ 図2D）に基づく。ヒストグラムプロット内のゲートP4に含まれるセルを描いたときに、 低 GFP陰性、GFP（ゲートP5）の明確な分離と高い GFP（ゲートP6）細胞（ 図2E）に表示されます。下のGFP強度を示す細胞は小さく、少なく粒状であるとのISCを表します。高いGFPのint型を示す細胞ensityはより大きく、より粒状であるとしたEBを表します。各GFP陽性集団の細胞のRNAから合成したcDNA上のDI用転写酵素（RT）-PCRリバース（ゲートP5、P6）がDL信号が大きく、GFP 高よりも小さく、GFP low細胞において確かに強力であることを明らかにした細胞（ 図2H）。次いで、細胞をGFP 低い （ゲートP5）とGFP 高い （ゲートP6）細胞サイズおよび粒度（ 図2F）が異なり、まだ（ 図2G）生存していることを確認するために等高線プロットにbackgatedと示された。 FITC（GFP）チャネルプロトコルに記載のコントロールを使用して適切に較正されている場合は注目すべきことに、GFP陽性細胞（ 高い GFP 低 GFP）の2つのピークのみをうまく区別することができる。 古いガッツ（ 図3）に由来するのISCをソートするとき、同じゲート戦略を使用した。散布図（FIGUR電子3A-D）、ヒストグラム（ 図3E）と等高線プロット（ 図3F、G）は、図2に示したものに類似している。上述したように、したがって、そこに古い中腸でのISCを識別するためのない真正なマーカーがなく、無RT-PCRデータは、ここに提示されている。しかし、ここで興味深い観察は、GFP 低い （ゲートP5）またはGFP 高 （ゲートP6）細胞を含む二つのピークがはっきりと高齢化の間に分離されたままということです。さらに、GFP 高い （ゲートP6）における細胞の数は、ピークが顕著に明らかに年齢とともにmisdifferentiated EBの既知の蓄積をエミュレートしている、熟成中に増加する。 2つの細胞集団の比率の変化はまた、散布図（ 図2A-Dと図3A-Dを比較）及び等高線プロット（ 図2F、Gで図3F、Gの比較）において見られる。これらの知見から、我々は、GFPのためにソートすることによってことを締結私たちは老いも若きも中腸内のISCとEBSの豊かにすることができ、FACSを使用して陽性細胞。 孤立のISCとEBの純度を検証するために、ポストソート分析は（ 図4）を行った。ポストソートのISCとのEB（ 図4B、C）のヒストグラムプロットは、95％と98％の間の純度を示す。 上記のようにFACSパラメータを設定する階層が厳密に続いている場合、（GFP、 低小さく、GFP 高く 、それ以上）の2つの異なる細胞集団がすでにFSC-A（ 図5A）対散布図GFPに区別することができる。この階層は（ 図5B-D）は無視されている場合は、これら2つの細胞集団を区別することはできません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig1highres.jpg" /> 図1：（A）ディッセの主要なステップの概略フライ腸をテレビや。まず、ヘッドが腸を露出する胸部と腹部の分離に続いて（羽の除去は任意である）を除去する。腸は、その後、次の手順で体腔から解放されます。暗赤色の矢印は引っ張り方向を表すのに対し、黒矢印は、解剖の進行を示している。最後の画像の赤い線は、中腸の前方および後方の境界を示している。（B）大人のハエの腸の光顕微鏡画像。メイン領域及び解剖学的特徴は、標識されている。赤い線は中腸の境界をマークします。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig2highres.jpg" /> 図2：FACは若い（7日間）中腸からのISCとしたEBを同定および単離するための戦略をソートするより良い視覚化のために、のISCを表す細胞は赤色で強調表示されているとしたEBを表すセルが強調表示されます。散布図（AD）における青色及び等高線プロット（F、G）中で（A）P1のゲートは、対数y軸に10 3上にプロットされた死んだ、SYTOX陽性細胞を除外するように設定されている。 FSC-Aの閾値はまた、死細胞および残骸を排除するために40に設定されている。（B）細胞を、サイズおよび粒度（ゲートP2）に応じてセルを選択するためにFSC-AおよびSSC-Aについてゲーティングした。ヒストグラムプロット（E）は、SSC-散布図（B）対FSC-AにおけるGFP陽性細胞を同定するために並列で使用された（C、D）FSC-W対散布FSC-H及びSSC-W対SSC-Hは、（DにおけるC及びゲートP4ゲートP3）凝集体および二重項を削除し、シングレットを選択するために役立つ。（E）ヒストグラムプロットは、細胞の数およびそれらのGFP強度を示す。二つのピーク、GFP 低い （ゲートP5）と高い GFP（ゲートP6）を識別することができる。（F、G）細胞は、二つの別個のGFP陽性細胞populatことを確認するために、等高線図には、ゲートした最初のピーク（ゲートP5）に存在する細胞から単離されたRNAから合成したcDNA上のDIための逆転写酵素（RT）-PCRとのイオンが正しいサイズ（F）のものであり、含まれている生細胞（G）（H）それぞれ第二のピーク（ゲートP6）、。以上のDI発現ゲートP6対ゲートP5に存在する細胞で検出することができた。チューブリンをローディング対照とした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig3highres.jpg" /> 図3：FACが古い（60日）中腸からのISCとしたEBを同定および単離するための戦略をソートするより良い視覚化のために、のISCを表す細胞は赤色で強調表示されているとしたEBを表す細胞は散布図（AD）にし、青色で強調表示されます。等高線プロット（F、G）。（A）P1のゲートは、対数y軸に10 3上にプロットされた死んだ、SYTOX陽性細胞を除外するように設定されている。 FSC-Aの閾値はまた、死細胞および残骸を排除するために40に設定されている。注目すべきは、大きなGFP陽性細胞における年齢依存性の増加が、このプロットにすでに明らかである。（B）細胞サイズおよび粒度（ゲートP2）に応じてセルを選択するためにFSC-AおよびSSC-Aについてゲーティングした。ヒストグラムプロット（E）は、SSC-散布図（B）対FSC-AにおけるGFP陽性細胞を同定するために並列で使用された（C、D）FSC-W対散布FSC-H及びSSC-W対SSC-Hは、（DにおけるC及びゲートP4ゲートP3）凝集体および二重項を削除し、シングレットを選択するために役立つ。（E）ヒストグラムプロットは、細胞の数およびそれらのGFP強度を示す。二つのピーク、GFP 低い （ゲートP5）と高い GFP（ゲートP6）を区別することができる。注目すべきは、より大きな細胞を含む細胞集団GFPの高い i は増加している高齢化の間にn個。（F、G）細胞は、2つの異なるGFP陽性細胞集団は正しいサイズ（F）のものであり、生きた細胞（G）が含まれていることを確認するための等高線図には、ゲートした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig3large.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig4highres.jpg" /> 図4：ポストソート分析は孤立のISCとEBの純度を決定するために実施した（A）GFP陽性若いから細胞（7日間）と古い（60日）中腸FACはソートされ、ヒストグラムプロットは、その分布を示した。 GFP強度に基づいて二つのピークに。（B）ポストソート分析は&gt; 97％であり、老いも若きも中腸からの孤立のISCの純度を示している。（C）ソートされたEのポストソート解析老いも若きも中腸からのBsは&gt; 95％の純度を示しています。わずかな不純物が蛍光消光または細胞を再ソートすることによって引き起こされる機械的に損傷したGFPを発現する細胞から生じ得る。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig5highres.jpg" /> 図5：FACSパラメータが正しく設定されていなかったときに見ている次善のFACSデータを示して散布図の例としては 、FACSパラメータはプロトコルに記載の制御に基づいて適切に設定されたすべての細胞の（A）代表FACSプロファイル。。のISCを含む細胞集団は赤で丸で囲まれているとしたEBを含む細胞集団は、青い丸で囲まれている。緑色の丸で囲ま細胞はに比べて、より強い自己蛍光を持って死んだ細胞である対数y軸に10 3の下にプロットされている生きた細胞、（B）散布図FACS機器のキャリブレーションされなかった場合に得られる典型的な結果を示している。いいえGFP陽性細胞が検出されない。FSCが正しく設定されていない場合は、別のGFP陽性細胞集団が検出されない（C）（D）FITC（GFP）チャネルが正しく調整されていない場合は、GFP-の大部分をソートされる陽性細胞は、散布図ではなく、むしろ、プロットの上縁に沿ってプロットされません。また、ここに示したプロットに、自家蛍光の制限は、細胞を、対数y軸にプロット上10 2が実際に自己蛍光であり、GFP陽性細胞と誤認することができること、したがって、調整しなかった。

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Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

大人から腸管幹細胞を単離<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; FACSによる中腸は老化中の幹細胞の挙動を研究するために

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

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Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

20.1K ビュー.  Universität Ulm. Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging. 

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

がん研究

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of individual cell populations often makes it difficult to obtain enough material for molecular studies. For example, the accessory gland of the Drosophila male reproductive system contains two distinct secretory cell types. The main cells make up 96% of the secretory cells of the gland, while the secondary cells (SC) make up the remaining 4% of cells (about 80 cells per male). Although both cell types produce important components of the seminal fluid, only a few genes are known to be specific to the SCs. The rarity of SCs has, thus far, hindered transcriptomic analysis study of this important cell type. Here, a method is presented that allows for the purification of SCs for RNA extraction and sequencing. The protocol consists in first dissecting glands from flies expressing a SC-specific GFP reporter and then subjecting these glands to protease digestion and mechanical dissociation to obtain individual cells. Following these steps, individual, living, GFP-marked cells are sorted using a fluorescent activated cell sorter (FACS) for RNA purification. This procedure yields SC-specific RNAs from ~40 males per condition for downstream RT-qPCR and/or RNA sequencing in the course of one day. The rapidity and simplicity of the procedure allows for the transcriptomes of many different flies, from different genotypes or environmental conditions, to be determined in a short period of time.

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Here, we present a protocol to dissociate and sort a specific cell population from the Drosophila male accessory glands (secondary cells) for RNA sequencing and RT-qPCR. Cell isolation is accomplished through FACS purification of GFP-expressing secondary cells after a multistep-dissociation process requiring dissection, proteases digestion and mechanical dispersion.

ショウジョウバエ男性アクセサリー腺の二次細胞からRNAを分離するFACSベースのプロトコル

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

遺伝学

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

発生生物学

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

生物学

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

大人から腸管幹細胞を単離

要約

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ザ

ショウジョウバエ男性アクセサリー腺の二次細胞からRNAを分離するFACSベースのプロトコル

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

後期胚性ショウジョウバエ生殖腺の解剖とライブイメージング

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

の分離キイロショウジョウバエ精巣

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

解剖、イメージング、および薬理学的治療：ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

大人から腸管幹細胞を単離

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ショウジョウバエ男性アクセサリー腺の二次細胞からRNAを分離するFACSベースのプロトコル

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

の分離キイロショウジョウバエ精巣

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

後期胚性ショウジョウバエ生殖腺の解剖とライブイメージング

解剖、イメージング、および薬理学的治療：ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養