このモデルは、in vitroで末梢神経系の髄鞘形成の様々な側面を研究するための実験的機会を提供する。ミエリンの定量と軸索-シュワン細胞相互作用の検査を可能にします。共培養は、14日目以降に強力な髄鞘形成を発症します。
DRG外植片培養は、解離したニューロン培養と比較して、無傷の構造構造の利点を提供します。この方法は、末梢神経系の炎症性疾患および神経変性疾患に対する向性化合物のスクリーニングに利用可能です。まず、安楽死させたラットの胴体の作業領域を70%エタノールで滅菌します。
ラットの左背下肢をハサミで開き、上腕二頭筋の大腿骨筋を慎重に取り除きます。湾曲した鉗子で滑らかな隆起によって坐骨神経を緩め、神経を傷つけないようにします。鉗子を使用して、 切り取られた神経を、ゲンタマイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含む氷冷ライボビッツのL-15培地を含む組織培養皿に移します。
次に、実体顕微鏡を使用して、2対の細かい鉗子で神経から脂肪、筋肉、血管を取り除きます。坐骨神経の近位端と遠位端を特定し、近位神経端を2対の細かい鉗子で保持しながら、近位から遠位方向に1対の細かい鉗子で上神経を取り除きます。精製した神経を、ゲンタマイシンを含む氷冷したライボビッツのL-15培地で別の組織培養皿に移した後、単離された神経束をいじめ、2対の細い鉗子を使用して単一の神経線維を分離および分離します。
10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して神経線維を50ミリリットルのチューブに移し、できるだけ少ない培地を取ります。次に、ゲンタマイシンを含む50ミリリットルのリーボビッツL15培地を神経線維に数回加えます。神経線維を含むチューブを188Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。
上清を除去した後、残りのLeibovitzのL-15培地を含むペレットを60ミリメートルの組織培養皿に移します。50ミリリットルのチューブを10ミリリットルの酵素消化溶液ですすぎ、神経線維皿に加えます。ピペットの先端で皿の中の神経線維を慎重に分配します。
摂氏37度と5%二酸化炭素で18時間インキュベートします。そして、HBSSに40%FCSで10ミリリットルを加えて酵素消化を停止します。消化した神経を50ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で10分間188Gで遠心分離します。
上清を廃棄した後、10%FCSおよびゲンタマイシン1ミリリットル当たり50マイクログラムを含む10ミリリットルのDMEMにペレットを再懸濁する。次に、細胞懸濁液を100マイクロメートルの細胞ストレーナーでろ過します。摂氏4度で188Gで10分間遠心分離した後、FCSとゲンタマイシンを含む4ミリリットルのDMEMでペレットを再懸濁します。
2つのポリリジンおよびラミニンコーティングされた60ミリメートル組織培養皿のそれぞれに2ミリリットルの細胞懸濁液を加える。摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートし、プレートをインキュベーター内で2日間そのままにします。このシュワン細胞懸濁液を188Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞ペレットを1回あたり90マイクロリットルの磁気細胞分離バッファーに1回ずつ10〜7番目の細胞に再懸濁した。
次に、10番目のセルに10回あたり10マイクロリットルのti1マイクロビーズを追加します。再懸濁した溶液を摂氏8度の暗所で15分間インキュベートします。次に、2ミリリットルの磁気細胞分離バッファーを細胞懸濁液に加える。
摂氏4度で300Gで10分間遠心分離した後、ペレットを500マイクロリットルの磁気細胞分離バッファーに再懸濁します。磁気セル分離カラムをセルセパレータに入れ、1ミリリットルの磁気セル分離バッファーでカラムを湿らせます。次に、細胞をそれに適用して、遠心分離のためにフロースルーを収集します。
安楽死させた妊娠中のラットから子宮を慎重に取り除き、氷冷HBSSを含む100ミリメートルの組織培養皿に入れます。湾曲した鉗子を使用して子宮を保持し、細かい鉗子で子宮壁を開きます。羊水袋を1つ取り出し、細かい鉗子で穴をつまんで慎重に開きます。
子宮からすべての胚をすばやく取り除き、HBSSで満たされた皿に移します。1つの胚の胴体をHBSSで満たされた35ミリメートルの皿にそっと入れます。実体顕微鏡下で、胴体の背側部分を開いて胚を2つに分割します。
半分を横に回して、胚の背部の線に位置する後根神経節(DRG)の鎖を特定します。細かい鉗子とマイクロハサミを使用して、DRGをストランド全体として切り取ります。2ミリリットルのHBSSで満たされた新鮮な皿にDRGを入れた後、細かい鉗子とマイクロハサミを使用して、残りの組織から単一のDRGを分離します。
各ウェルに190マイクロリットルのDRG増殖培地を含む4ウェルプレートを取り、細かい鉗子とヘラを使用して単一のDRGを各ウェルの中央に慎重に移します。次に、DRG外植片培養物を摂氏37度と5%二酸化炭素のインキュベーターに入れます。翌日、50マイクロリットルのDRG増殖培地を各ウェルに注意深く添加し、顕微鏡を使用してDRG外植片の付着と軸索の成長を毎日観察します。
DRG外植片培養の3日目に共培養するには、DRG増殖培地を、ウェルあたり30, 000シュワン細胞を含む250マイクロリットルの共培養培地と慎重に交換します。免疫細胞化学染色を行うには、DPBS洗浄した細胞を4%パラホルムアルデヒド中で10分間インキュベートすることにより、カバースリップ上に細胞を固定します。倒立顕微鏡を使用して、中央のDRG外植片を囲む8つの定義された領域で免疫細胞化学的に染色されたサンプルの写真を撮ります。
ここでは、細長い紡錘形の形態を持つシュワン細胞と、共培養における薄いDRG軸索の出現を示しています。共培養における髄鞘形成は、ミエリン塩基性タンパク質またはMBP、β3チューブリン、およびDAPIについてDRG外植片およびシュワン細胞を染色することによって異なる日に評価した。共培養における軸索網は密集しており、観察の経時変化において目に見えて変化しなかった。
髄鞘形成の最初の兆候は、共培養の10日目と12日目に見られました。14日目からMVPシグナルがより顕著になり、ミエリン包内軸索が検出された。髄鞘形成は20日目までの共培養時間とともに増加した。
髄鞘形成は、MVPとβ3つのチューブリン陽性領域の比率として定量した。髄鞘形成の有意な増加は、10日目と比較して18日目および20日目に観察された。DRG外植片培養は壊れやすいため、慎重に取り扱う必要があります。
例えば、インキュベーターから取り出したとき、または培地交換および固定中である。共培養サンプルの遺伝子発現解析は、ミエリンをより詳細に調査するために形成することができる。ここでは、22日目にミエリンマーカーPMP22、MAG、Oct6、Egr2、Olig1を検出しました。
