この修正されたELISAプロトコルにより、ヒト血漿中のCGRPの精製と正確な定量が可能になります。必要な検証実験を経ており、将来の定量化手法の標準化に役立ちます。このプロトコルは、プロテアーゼの大幅な分解前のサンプル処理、固相抽出による精製、およびマイクロタイタープレートへのブロッキングバッファーの適用による非特異的結合の制限を含むという利点を提供します。
CGRPは片頭痛の病態生理学において懲罰的な役割を果たし、おそらくバイオマーカー状態の候補です。また、心臓病学、皮膚科、ウイルス、さらにはCOVID-19関連の疾患プロセスにも関与しています。まず、標準的な静脈穿刺法で肘前静脈から5ミリリットルの全血を6ミリリットルのバキュテイナーEDTAチューブに集めます。
標的ペプチドの溶解を阻止するために、0.5ミリリットルのアプロチニン競合セリンプロテアーゼ阻害剤を添加する。チューブを10回反転させ、次のステップまで氷上に保管します。次に、チューブを600 4gで摂氏4度で4分間遠心分離します。
そして、血漿画分を2ミリリットルの丸底滅菌クライオバイアルに移す。クライオバイアルを摂氏マイナス80度で最大2週間すぐに保管してください。血漿サンプルを抽出するには、15ミリリットルの円錐形遠心管内に抽出カートリッジを置きます。
5ミリリットルの100%メタノール、次に10ミリリットルの超純水をカートリッジに通して作動させます。流体は、重力駆動の流れによってカートリッジを通過するときにチューブに集められます。カートリッジがカートリッジを飲み込まないように、蓄積した余分な液体を廃棄し、実験中に乾燥しないようにします。
250マイクロリットルの血漿を750マイクロリットルの4%酢酸で希釈し、ゆっくりとカートリッジに通します。次に、カートリッジを10ミリリットルの酢酸で洗浄します。余分な液体が除去されたら、カートリッジを新しい15ミリリットルの円錐形遠心管に移します。
3ミリリットルのメタノール酢酸溶液を調製して、カルシトニン遺伝子関連ペプチドまたはCGRPを溶出する。そのうち1ミリリットルをカートリッジに通し、各溶出の間に25分間待ちます。最後の溶出後、チューブには3ミリリットルの総溶離液が含まれています。
1ミリリットルの溶離液を1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、ミニ遠心分離機で1秒間回転させて溶離液を沈降させます。次に、1, 400 RPMおよび摂氏4度の真空遠心分離機でサンプルを乾燥させます。アッセイの直前に、乾燥したサンプルを解凍した酵素免疫測定法またはEIAバッファーで再構成する。
プレートブロッキングのために、250マイクロリットルのTBS魚ゼラチンブロッキングバッファーを各ウェルに加えます。プレートの上にカバーシートを置き、室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、カバーシートをはがし、プレートをひっくり返して空にします。
次に、プレートをペーパータオルで拭き取り、微量の液体を捨て、層流フードで10分間乾燥させます。プレートが目に見えて乾いたら、シリカゲル乾燥剤サシェ付きのグリップシールホイルポーチに入れます。マイナス20°Cで24時間保管してください。
アッセイを実行する前に、すべてのサンプルと調製した試薬を室温で解凍します。ブロックプレートのウェルをすすぐには、300マイクロリットルの洗浄バッファーを追加し、30秒間放置します。その後、洗浄バッファーを廃棄し、すすぎを5回繰り返します。
最後のすすぎの後、前に示したようにプレートを吸い取ります。次に、100マイクロリットルのEIAバッファーを専用の2つの非特異的結合またはNSBウェルに分注します。100マイクロリットルのCGRP標準物質を追加し、続いて再構成されたサンプルと品質管理を適切なウェルに複製します。
ブランクウェルを除く各ウェルに100マイクロリットルのCGRPトレーサーを追加します。最後に、透明なカバーシートを使用してプレートを密封し、サンプルと試薬が蒸発しないようにし、プレートを摂氏4度で16〜20時間インキュベートします。インキュベーション期間が終了したら、製造元の指示に従ってエルマン試薬を準備します。
プレートをデカントしたら、前に示したように各ウェルを3回洗浄します。最後のすすぎの後、プレートを120 RPMで2分間振ってください。もう一度、プレートを3回すすぎ、吸い取って乾かします。
液体がウェルから目に見えて除去されるまで、逆さのプレートをタップします。次に、ブランクウェルを除く各ウェルに200マイクロリットルのエルマン試薬を追加します。プレートが覆われたら、光にさらされないようにアルミホイルで包み、吸光度を記録する前に室温で1時間暗所でインキュベートします。
本研究は、ブロッキングステップの追加により、各CGRPスパイクサンプルにおける回収率が許容範囲内であったことを実証した。しかし、ブロッキングステップを除外した場合、非特異的結合により回収率が上限の125%を超えるCGRP分解を制限するために、採取直後に血液サンプルを保持するためにアプロチニンを添加することが重要です。さらに、ブロッキングバッファーをELISAの前にマイクロタイタープレートに追加して、非特異的結合をさらに減らす必要があります。
したがって、このプロトコルは、片頭痛および前庭片頭痛の血漿患者のCGRPのレベルを定量化することにより、前庭片頭痛のバイオマーカーとしてのCGRPの候補を対照と比較するために利用できます。
