この方法は、三叉神経血管系からのCGRPの放出に関与するメカニズムを調べるためのツールです。この方法の主な利点は、三叉神経血管系を3つの異なる部位に分割し、各部位内でのCGRPの放出を評価できることです。手順を実演するのは、私と私たちのグループの上級科学者であるInger Jansen-Olesenです。
はじめに、ハサミを使って頭頸部の周りの皮膚と筋肉を取り除き、ラット組織を準備します。次に、骨トリマーとはさみを使用して、下顎を頭から分離します。次に、椎骨の背部に尾状に骨トリマーを挿入して脊髄と脳幹を露出させ、それを取り除きます。
次に、後頭骨と頭頂間骨の境界で頭蓋骨の尾側部分を切り取り、これらの骨構造を取り除き、小脳を露出させます。両側のブレグマから約13〜16ミリメートルの尾方向に走っているTNCを隔離するには、脳幹の背外側部分をスプリングハサミで切ります。その後、左側と右側のTNCをSIFに浸します。
次に、のこぎりを使って頭蓋骨を2つに分けるために頭を矢状中程度に切ります。次に、ヘラを使用して頭蓋に付着した硬膜に触れずに脳を慎重に取り外します。TGを分離するには、下顎枝が卵円孔に入り、眼科枝と上顎枝が頭蓋骨に入る視覚的境界の周りの枝を含めてTGを切断します。
次に、頭蓋骨の半分とTGをSIFに浸します。マウス組織を準備するには、ハサミを使用して頭頸部の周りの皮膚と筋肉を取り除きます。次に、はさみを椎骨の背側に尾側に挿入して脊髄と脳幹を露出させ、取り外します。
次に、後頭骨と頭頂間骨の境界で頭蓋骨の尾側部分を切り取り、小脳を露出させるこれらの骨構造を取り除きます。頭頂骨を矢状中央に切り、骨を取り除くと大脳が露出します。ヘラを使用して小脳を慎重に取り除き、脳幹を露出させます。
脳幹の一部を含むTNCをスプリングハサミで単離し、続いて脳幹をSIFに浸します。次に、へらを使用して脳を慎重に取り外し、脳幹に入る三叉神経を切ります。TGを分離するには、卵円孔に入る下顎枝と頭蓋骨に入る眼科および上顎枝との視覚的境界の周りの枝を含めてTGを切り取ります。
次に、TGをSIFに浸します。SIFを簡単に交換できるように、プラスチック容器に料金の蓋を追加し、5分ごとにSIFを交換して、SIFでラットとマウスの組織を30分間洗浄し始めます。室温で30分間洗浄した後、ラットTNCハーフとラットTGを350マイクロリットルのSIFで分離した微量遠心チューブキャップに移します。
TNCを含むマウス脳幹を、250マイクロリットルのSIFを含む微量遠心チューブキャップに移します。最後に、2つのマウスTGを250マイクロリットルのSIFを備えたマイクロ遠心チューブキャップに移します。ラットの頭蓋骨の半分を6ウェル培養プレートに置き、頭蓋骨に400マイクロリットルのSIFを満たします。
ラットの頭蓋骨を、ラットとマウスの組織を入れた微量遠心チューブキャップに入れ、摂氏37度の加湿インキュベーターに入れます。組織に触れずに5分ごとに20分間ピペットを使用してSIFを交換します。適切なラベリングにより、サンプル収集用の微量遠心チューブを準備します。
次に、50マイクロリットルの10強度EIAバッファーを各マイクロ遠心チューブに追加します。次に、全濃度のSIFで希釈して試験化合物溶液及びビヒクル溶液を調製する。最後の洗浄に続いて、マウスTGおよびTNCに250マイクロリットルのSIF、ラットTGおよびTNCに350マイクロリットルのSIF、および各ラット頭蓋骨に400マイクロリットルのSIFを加える。
10分間のインキュベーション後、50マイクロリットルの10強度EIAバッファーを含む事前にラベル付けされたマイクロ遠心チューブに200マイクロリットルのサンプルを収集し、基礎CGRP放出の測定を可能にします。残りの液体を廃棄し、すぐにサンプルを摂氏マイナス20度で保管してください。試験化合物を対応するビヒクルに最低濃度から始めて濃度を上げて加え、10分間インキュベートします。
10分間のインキュベーション後、50マイクロリットルの10濃度EIAバッファーを含む事前にラベル付けされたマイクロ遠心チューブに200マイクロリットルのサンプルを収集します。残りの液体を捨て、2番目に低い濃度をティッシュに加えます。すぐにサンプルを摂氏マイナス20度で保管し、残りの濃度でこの手順を繰り返します。
実験のポジティブコントロールを実行するには、プロトコルの最後にポジティブコントロールを組織に追加します。10分間のインキュベーション期間の後、50マイクロリットルの10強度EIAバッファーを含むマイクロ遠心チューブに200マイクロリットルのサンプルを収集します。収集されたサンプルで放出されたCGRPの濃度は、EIAキットに付属の製造元の指示に従って、EIAキットを使用して測定されます。
ラットでは、カプサイシン曝露は、ビヒクルと比較して硬膜およびTGからの有意なCGRP放出を誘導した。硬膜では、CGRPの最大放出はカプサイシンの1マイクロモルで見出された。そしてTGでは、最大CGRP放出はカプサイシンの10マイクロモルで見出された。
一元配置ANOVAで分析した場合、グリベンクラミドは硬膜およびTGからの基礎CGRP放出に影響を示さない。グリベンクラミドは、一元配置ANOVAで分析した場合、ビヒクルを含むカプサイシンと比較して、硬膜中のカプサイシン誘発性CGRP放出を40%、TGを39%有意に減少させました。.一過性受容器電位アンキリン-1アゴニストスーパーシンナムアルデヒドは、1、10、および100マイクロモルのスーパーシンナムアルデヒドを含むTGから濃度依存的にCGRPを放出し、双方向ANOVAで分析した場合、ビヒクルと比較してそれぞれ9%52%および69%増加したCGRPの放出をもたらすことがわかりました。一過性受容器電位アンキリン-1ノックアウトマウスのTGでは、1、10、および100マイクロモルのスーパーシンナムアルデヒドへの曝露により、双方向ANOVAで分析した場合、ビヒクルと比較してCGRPの放出にそれぞれ11%マイナス13%および9%の変化をもたらしたCGRPの放出の増加は見られませんでした。
サンプル採取中に組織に触れないように注意し、すべてのサンプルのインキュベーション時間を計るときは正確にすることが重要です。適切なELISAキットが利用可能であれば、この手順を適用して、三叉神経血管系に存在する他のペプチドの放出を測定することが可能である。
