胚性海馬ニューロンの凍結ストックを用いた容易で再現性の高い低密度初代培養

ラット胚性ニューロンの凍結ストックはすぐに使用でき、細胞を培養するための高度な技術は必要ありません。このテクニックは非常に簡単で、動物実験、時限妊娠動物の配置、または胚の解剖に許可は必要ありません。ニューロンは他の培養容器で培養し、他の種類の実験に適用することができます。

例えば、電気生理学的実験用の微小電極アレイプレート。まず、96ウェルマイクロプレートをウェルあたり100マイクロリットルのポリ-L-リジンでコーティングします。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。

インキュベーションの最後に、ポリ-L-リジン溶液を取り除きます。プレートを滅菌水で2回、サプリメントを含まない新鮮な培地で1回洗浄します。プレートを出して乾かします。

ドライプレートは、摂氏4度で最大1か月間包んで保管できます。細胞播種を開始するには、コーティングプレートの各ウェルに50マイクロリットルの培養液を追加します。周辺ウェルを200マイクロリットルの滅菌水で満たし、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で1時間インキュベートします。

液体窒素タンクからニューロンクライオバイアルを取り出し、摂氏37度のヒートブロックに入れて内容物を部分的に解凍します。先端が広い1ミリリットルのピペットを使用して、バイアルの内容物を滅菌済みの50ミリリットルのチューブにゆっくりと滴下します。空のクライオバイアルを1ミリリットルの室温培地ですすいでください。

すすぎ液を細胞懸濁液を含む50ミリリットルのチューブに移します。次に、室温培養液9ミリリットルを50ミリリットルのチューブに滴下し、容量を11ミリリットルにします。血球計算盤を使用して細胞を計数した後、細胞懸濁液をリザーバーに移します。

次に、ワイドボアチップを備えたマルチチャンネルピペットを使用して、最終カウント10の1.0倍の細胞懸濁液を、コーティングされた96ウェルプレートにウェルあたり4つのセルに分注します。5%二酸化炭素下で摂氏37度で1〜2時間ニューロンをインキュベートします。その後、培養液を100マイクロリットルの予熱した培養液と交換し、同じ条件で再度インキュベートします。

in vitroで4日後、グリア細胞の増殖を抑えるために、ウェルあたり0.2マイクロモルの最終濃度でシトシンβ-D-アラビノフラノシドを追加します。プレートをインキュベーターに戻します。インビトロで21日後、目的の薬で細胞を処理します。

ポジティブコントロールを維持するには、細胞をウェルあたり100マイクロモルのグルタミン酸で、固定前に摂氏37度で10分間処理します。免疫細胞化学的研究を行う前に、培養液を各ウェル中の100マイクロリットルのパラホルムアルデヒドと交換して細胞を20分間固定します。固定後、ウェルあたり250マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水でウェルをそれぞれ5分間2回洗浄します。

本研究では、3週間培養液を交換することなく、ニューロンが正常に発達した。免疫組織化学により,MAP2陽性樹状突起に沿ってドレブリン陽性樹状突起棘を認めた.グルタミン酸刺激に対するドレブリンクラスター密度の用量依存的な減少が観察された。

細胞懸濁液が暖かくなりすぎる前に移植することは非常に重要です。培養液の滴下は、浸透圧の急激な変化を避けるためにも重要です。