이 기사는 주로 DESI-MSI를 사용하여 식물 샘플 및 이미징을 준비하는 비용 효율적인 방법을 설명하며 질소가 불어올 때 쉽게 부서지는 건조 조직과 관련된 단점을 극복할 수 있습니다. 뿌리는 저온 유지 장치 마이크로톰에서 냉동 절편된 반면, 잎은 각인으로 준비되었는데, 이는 값비싼 기계가 필요하거나 신호 강도를 잃습니다. 우리의 방법은 이러한 한계를 극복 할 수 있습니다.
이 방법은 비생물적 및 생물학적 스트레스를 받는 식물에서 독성 물질의 분포 및 이동과 같은 식물의 공간 대사체학에 사용할 수 있습니다. 시작하려면 2 년 된 샐비어 miltiorrhiza 식물에서 깨끗한 뿌리와 잎을 가져 와서 약 3-5 밀리미터의 단면 두께로 직접 자릅니다. 그런 다음 양면 테이프를 사용하여 접착 현미경 유리 슬라이드에 샘플을 붙입니다.
샘플 위에 다른 현미경 유리 슬라이드를 놓고 샌드위치와 같은 밀봉 필름으로 감쌉니다. 다음으로, 샌드위치 샘플을 섭씨 영하 80도에서 최소 4시간 동안 동결시킨 다음, 섭씨 영하 75도에서 영하 82도의 갇힌 온도와 2.5에서 3.7파스칼의 진공 게이지로 2시간 동안 공기 진공에 노출시킵니다. 분석을 위해, 냉장 보관에서 샘플을 꺼낸 후, 샘플을 매트릭스 적용하기 전에 샘플 표면에 응결을 방지하기 위해 데시케이터에서 실온으로 가져옵니다.
기기 검출기 설정 및 질량 교정을 전기 분무 이온화 또는 ESI 모드에서 구현합니다. 물 아세토니트릴에서 류신과 세팔린을 1:1의 비율로 사용하여 검출기 설정을 수행하고 포름산나트륨과 물 이소프로판올을 1:1의 비율로 사용하여 질량 보정을 수행합니다. ESI 소스를 꺼내고 DESI 장치를 질량분석기에 장착합니다.
질소 가스 공급 장치를 DESI 장치에 연결하고 가스 압력을 약 0.5메가파스칼로 조정합니다. 5 밀리리터 주사기에 류신과 세 팔린 및 포름산을 물 메탄올에 1 : 9의 비율로 채우고 주사기를 고성능 주사기 펌프에 부착하여 시료의 화학 물질 이온화를위한 용매를 제공합니다. 다음으로, 용매 제공 모세관을 주사기와 DESI 분무기에 부착합니다.
용매 제공 모세관은 내경이 75 마이크로미터이고 외경이 375 마이크로미터인 치수의 표준 모세관이다. 주사기 펌프를 시작하고 주입 속도를 분당 2 마이크로 리터로 설정하여 용매의 일정한 흐름과 스프레이를 얻습니다. 질소 가스 밸브를 껐다가 약 15초 후에 켭니다.
작은 방울의 용매가 무대 위로 뿜어져 나오고 용매 흐름이 일정한 상태이면 스프레이를 볼 수 있습니다. 다음으로 분무기 각도, XYZ 축, 돌출부 및 높이에 따라 분무기의 위치를 조정합니다. 빨간색과 검은색 마커를 참조로 사용하여 질량 분석 신호를 최적화하여 감도 모드에서 약 1배의 10에서 5분의 1의 신호 강도를 얻을 수 있습니다.
분무기의 돌출부가 신호 강도에 영향을 미치는 가장 중요한 요소이므로 5mm 렌치를 사용하여 질소 가스 가드를 변경하여 돌출부를 조정하십시오. 스프레이 방향은 매스 이미지의 품질에 영향을 미칩니다. 따라서 스프레이가 직선이 될 때까지 분무기를 돌립니다.
이 모든 단계가 끝나면 설정은 실험 준비가 완료되며 일반적으로 초기 설정 후 약 3주 동안 안정적으로 사용할 수 있습니다. DESI-MS 이미징의 경우 시료 전처리가 필요하지 않습니다. 그러나 가능하면 슬라이드에서 여분의 미디어를 제거하십시오.
슬라이드에서 샘플 이미지를 찍습니다. 어떤 불순든지 피하기 위하여 표본의 표면을 건드리지 않고, 2개의 판 위치, A와 B.Use가 위치에 적합하기 위하여 표준 활주 또는 가득 차있는 활주가 있는 DESI 단계에 판 위치에 활주를 두십시오. 전체 슬라이드는 최대 4개의 슬라이드를 수용할 수 있으므로 실험을 위한 훨씬 더 넓은 영역을 갖습니다.
고화질 대량 이미지 처리 소프트웨어를 엽니다. 획득(Acquire) 탭에서 새 플레이트를 설정하고 올바른 플레이트 위치(A 또는 B)와 플레이트 유형을 선택합니다. 이미지 선택 페이지에서 슬라이드의 네 모서리를 선택하면 이미지가 올바른 방향으로 자동 조정됩니다.
MS 파라미터를 설정하려면 일반적으로 사용되는 DESI-MS 모드로 실험 유형을 선택하여 모이온만 검출합니다. 다음으로, 기기가 실험에서 하나의 극성만 사용할 수 있으므로 극성을 양극 또는 음수로 선택합니다. 그런 다음 감도 모드를 적용하여 소량의 화학 물질에 대한 자세한 정보를 얻으십시오.
그런 다음 사각형을 그려 패턴 탭에서 스캔 영역을 정의하고 픽셀의 X 및 Y 크기를 동일하게 유지하여 픽셀 크기를 설정합니다. 스캔 속도를 픽셀 크기의 5배 이하로 설정합니다. 프로젝트를 저장하고 MS 수집 소프트웨어용 워크시트를 내보냅니다.
그런 다음 워크시트를 MS 수집 소프트웨어로 가져와서 새 샘플 목록으로 저장합니다. Start Run을 눌러 MS 이미지 스캔을 시작하고 더 많은 워크시트를 가져와서 여러 이미지를 실험 대기열에 추가할 수 있습니다. 샘플의 데이터 파일을 대량 이미지 처리 소프트웨어에 로드하고 DESI 이미지 처리를 위한 매개변수를 설정합니다.
류신과 세팔린이 내부 잠금 질량에 사용되었고 잠금 질량이 실험의 극성을 식별하는 유일한 지점이기 때문에 올바른 잠금 질량을 설정하는 것이 중요합니다. 포지티브 모드의 경우 556.2772를 설정하고 네거티브 모드의 경우 554.2620을 설정합니다. 대상 화학물질 목록을 작성하려면 처리된 데이터 파일을 불러와 시료의 DESI 이미지를 시각화합니다.
정규화 버튼을 클릭하여 총 이온 크로마토그래피로 데이터를 정규화하여 특정 화학 물질의 상대 강도를 기준으로 얻은 다음 다른 샘플을 서로 비교할 수 있습니다. 관심 영역(ROI)을 그리고 샘플 이미지에 여러 복사본을 복사합니다. 그런 다음 모든 ROI를 선택하고 다변량 분석을 내보내 모든 ROI에서 MS 정보를 추출합니다.
뿌리 및 전체 잎 부분의 질량 분석 이미징은 선택된 화합물의 공간 분포를 보여줍니다. 모든 단일 픽셀의 색상은 질량 대 전하 비율의 상대적 강도를 나타내며, 따라서 샘플 전체에 걸친 대사 산물 이온의 자연 분포 및 풍부도와 연관될 수 있습니다. 표적 화합물인 탄시논 IIA와 로즈마린산의 분포는 뿌리의 다른 영역에서 볼 수 있습니다.
화합물 tanshinol A는 재현성을 목표로 하는 프로토콜로서 잎 절편에서 검출되었으며, 가장 중요한 것은 분무기의 위치를 여러 차원으로 조정하여 신호 강도를 최적화하는 것입니다.
