このプロトコルは、心血管疾患の最も重要な予測因子である血管石灰化の評価を支援し、将来的には治療法の開発に役立つ方法を提供します。EVを分離する能力により、血管石灰化につながるメカニズムと血管平滑筋細胞の表現型変化をさらに研究することができます。この技術は、血管平滑筋細胞を介した石灰化の初期分子メカニズムへの洞察を提供します。
これを理解することで、理解されたメカニズムについて治療オプションを研究することができます。興味のあるEVは、この方法を使用して調査できます。血管平滑筋細胞、骨芽細胞、または血管石灰化に限定されません。
マウスを安楽死させた後、ピンセットを使用して皮膚を持ち上げ、正中線を切開します。余分な皮膚や脂肪を取り除きます。次に、正中線の外側の生殖器官、膀胱、脂肪を取り除きます。
次に、胃腸器官を右側に移動し、正中線の腸に従います。見つかったら、正中線を持ち上げ、胃腸管を胃まで切除します。腎臓を正中線から持ち上げて切除します。
できるだけ腎臓の近くで切ります。葉を持ち上げて正中線から切り取って肝臓を取り除きます。次に、10ミリリットルの注射器を使用して冷たいPBSを右心室に注射することにより、心臓と大動脈を灌流します。
肺が膨らむのを待ち、白くなります。肺と余分な横隔膜、または胸郭を取り除きます。骨を取り除くには、はさみを大きく開き、尾の上のマウスの下部に配置します。
下向きに切り、背骨を皮膚から持ち上げ、正中線の側面から脂肪を取り除きます。皮膚が剥離したら、心臓の真上を切って脊椎と無傷の臓器を切除します。ステレオスコープに輸送する場合は、脊椎と無傷の臓器をアイスバケットのPBSのビーカーに入れます。
脊椎と臓器を解剖皿に移動した後、氷のように冷たいPBSで満たし、針を使用して脊椎と胸郭を固定します。解剖顕微鏡下で、ピンセットを使用して心臓を注意深く持ち上げ、脊椎の上と大動脈の下を切断し始めます。背骨の下部に達するまでこれを続けます。
解剖皿から背骨を取り除き、心臓と無関係な脂肪、または筋肉を固定します。心臓の真下の領域から始めて、食道、大静脈、大動脈を特定します。食道と大静脈を取り除き、大動脈の明確な視野を作ります。
微小解剖鉗子とはさみを使用して、脂肪組織を持ち上げ始め、大動脈のできるだけ近くで切断します。すべての大動脈と大腿動脈が露出するまで、これを内側線に沿って続けます。心臓で、大動脈弓の3つの枝を露出させているすべての脂肪組織を取り除きます。
左心室に微小解剖ハサミを挿入し、大動脈周囲の筋肉を切断して左心室から大動脈根を取り除きます。大動脈を分離して洗浄したら、近赤外線スキャナーを使用して大動脈を画像化し、血管石灰化を視覚化します。カスタムMATLABスクリプトを使用して、スキャンされた大動脈領域の合計に正規化されたカルシウムトレーサーの総信号を定量化します。
大動脈の近赤外線スキャンからTIFファイルの場所にMATLABを指示し、個々のファイルを開き、TIFファイルからピクセル強度の値を抽出します。石灰化が最も大きい大動脈をカラーマップ画像のスケール最大値として選択します。ウィンドウに「画像内の標本の数」コマンドが表示されたら、現在の画像内の大動脈の数を入力し、各大動脈を1つずつ選択します。
大動脈が選択されると、MATLABは大動脈の総面積と石灰化領域のマスクを使用してバイナリ画像を作成します。次に、これらのマスクされた画像の値を使用して、石灰化領域の合計、大動脈の総面積、石灰化に陽性のパーセンテージ領域、および石灰化領域の平均強度を決定します。大動脈をスキャンした直後に、2〜3個の大動脈をプールして十分なタンパク質濃度を得る。
2〜3個のプールされた大動脈を1.5ミリリットルの消化液に摂氏37度で2時間インキュベートします。溶液を収集し、1, 000 gで15分間遠心分離して細胞破片を除去します。次に、微小胞を除去し、上清を33, 000gで30分間遠心分離する。
石灰化の可能性について上清を収集して評価します。遠心分離により馴化回収培地から細胞残渣を除去した後、回収した上清を33, 000gで30分間回転させる。上清を集めて新しいチューブに移します。
次に、細胞外小胞サンプルに1%の300ミリモルリン酸二水素ナトリウムを加え、ピペッティングによって溶液を混合します。200マイクロリットルの混合溶液を96ウェルプレートに移し、96ウェルプレートをマイクロプレートリーダーで摂氏37度でインキュベートします。プレートリーダーを設定して、1分ごとに340ナノメートルの波長の吸光度を記録します。
コラーゲン溶液300マイクロリットルを8ウェルチャンバーガラスの各ウェルにピペットし、摂氏37度および5%二酸化炭素で72時間インキュベートする。インキュベーション後、コントロールとして300マイクロリットルのDMEMをウェルに加えます。以前に収集した300マイクロリットルの細胞外小胞培地サンプルを残りのウェルに加え、前述のように6日間インキュベートします。
10日目に、2.5マイクロリットルのOsteoSenseおよびDMEM混合物を各ウェルにピペットで入れ、24時間インキュベートする。インキュベーションの最後に、倒立顕微鏡を使用してカバーガラスチャンバーの底部から、または作動距離の長い対物レンズで上部から、OsteoSense蛍光フィルターを使用してヒドロゲルを画像化します。ImageJで利用可能な粒子分析オプションを使用して、石灰化の数と石灰化のサイズと収集された画像を評価します。
次に、[画像]に移動し、[調整]を選択し、[しきい値]をクリックして画像をバイナリ化し、OsteoSense信号のみが白く表示されるようにします。次に、[解析] を使用し、[パーティクルの解析] コマンドをクリックして、画像内の各石灰化に関する情報を取得します。分析する各画像の一貫性のために同じしきい値パラメーターを使用します。
解剖された大動脈の近赤外光学スキャナーイメージングは、対照マウスからの2つの大動脈よりも慢性腎臓病のマウスの大動脈全体で高いOsteoSense信号を示した。促進石灰培地で培養した血管平滑筋細胞から得られた馴化培地は、対照培地よりも340ナノメートルで高い吸光度を示した。吸光度の増加は、対照サンプルと比較して、石灰化促進サンプルで1.5倍速く発生しました。
石灰化促進条件で培養された細胞からの馴化培地には、ミネラル沈着物が含まれていました。大動脈を微小解剖するときは、大動脈の周りの脂肪を慎重にカットすることが重要です。できるだけ多くの大動脈を分析したいのですが、これはかなり面倒な場合があります。
EVが分離されると、アルカリホスファターゼ活性アッセイや免疫体などの追加のテストを完了できます。これらのテストは、EVに存在するメカニズムとタンパク質をさらに示します。
