이 프로토콜은 심혈관 질환의 가장 중요한 예측 인자인 혈관 석회화를 평가하고 향후 개발하는 데 도움이 될 수 있는 방법을 제공합니다. EV를 분리하는 능력을 통해 혈관 석회화로 이어지는 메커니즘과 혈관 평활근 세포의 표현형 변화를 추가로 연구할 수 있습니다. 이 기술은 혈관 평활근 세포 매개 석회화의 초기 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.
이를 이해하면 이해된 메커니즘에 대한 치료 옵션을 연구할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 관심 있는 모든 EV를 연구할 수 있습니다. 혈관 평활근 세포, 조골세포 또는 혈관 석회화에만 국한된 것은 아닙니다.
마우스를 안락사시킨 후 핀셋을 사용하여 피부를 들어 올리고 정중선 아래로 절개합니다. 과도한 피부나 지방을 제거하십시오. 그런 다음 정중선 외부의 생식 기관, 방광 및 지방을 제거하십시오.
그런 다음 위장 기관을 오른쪽으로 옮기고 정중선의 내장을 따르십시오. 발견되면 정중선을 들어 올리고 위장관을 위까지 절제하십시오. 신장을 정중선에서 들어 올려 절제하십시오.
가능한 한 신장에 가깝게 자릅니다. 돌출부를 들어 올리고 정중선에서 잘라내어 간을 제거합니다. 그런 다음 10밀리리터 주사기를 사용하여 차가운 PBS를 우심실에 주입하여 심장과 대동맥을 관류합니다.
폐가 팽창 할 때까지 기다렸다가 하얗게 변하십시오. 폐와 과도한 횡격막 또는 흉곽을 제거합니다. 뼈를 제거하려면 가위를 넓게 열고 꼬리 위의 마우스 아래쪽 영역에 놓습니다.
아래쪽으로 자르고 피부에서 척추를 들어 올리고 정중선 측면에서 지방을 제거합니다. 피부가 분리되면 심장 바로 위를 절단하여 척추와 손상되지 않은 장기를 절제합니다. 척추와 손상되지 않은 장기를 입체경으로 운반하는 경우 얼음 양동이의 PBS 비커에 넣습니다.
척추와 장기를 해부 접시에 옮긴 후 얼음처럼 차가운 PBS로 채우고 바늘을 사용하여 척추와 흉곽을 고정합니다. 해부 현미경으로 핀셋을 사용하여 심장을 조심스럽게 들어 올리고 척추 위와 대동맥 아래를 절단하기 시작합니다. 척추의 바닥에 도달 할 때까지 이것을 계속하십시오.
해부 접시에서 척추를 제거하고 심장과 외부 지방 또는 근육을 고정합니다. 심장 바로 아래 영역에서 시작하여 식도, 대정맥 및 대동맥을 식별합니다. 대동맥의 명확한 시야를 갖기 위해 식도와 대정맥을 제거하십시오.
미세 해부 겸자와 가위를 사용하여 지방 조직을 들어 올리고 가능한 한 대동맥에 가깝게 절단합니다. 모든 대동맥과 대퇴 동맥이 노출될 때까지 내측선을 따라 계속합니다. 심장에서 대동맥궁에서 세 가지를 노출시키는 모든 지방 조직을 제거합니다.
미세 박리 가위를 좌심실에 삽입하고 대동맥 주변 근육을 절단하여 좌심실에서 대동맥 뿌리를 제거합니다. 대동맥을 분리하고 세척한 후에는 근적외선 스캐너를 사용하여 대동맥을 영상화하여 혈관 석회화를 시각화합니다. 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 스캔된 전체 대동맥 영역으로 정규화된 칼슘 트레이서의 총 신호를 정량화합니다.
MATLAB을 대동맥의 근적외선 스캔에서 TIF 파일이 있는 위치로 이동시키고, 개별 파일을 열고, TIF 파일에서 픽셀 강도 값을 추출합니다. 석회화가 가장 큰 대동맥을 색상 매핑 이미지의 최대 척도로 선택합니다. 창에 How many specimens are in the image라는 명령이 나타나면 현재 영상의 대동맥 개수를 입력하고 각 대동맥을 하나씩 선택합니다.
대동맥이 선택되면 MATLAB은 대동맥의 전체 면적과 석회화된 면적의 마스크를 사용하여 이진 영상을 생성합니다. 그런 다음 이러한 마스킹된 이미지의 값을 사용하여 총 석회화 면적, 대동맥의 전체 면적, 석회화 양성 면적 백분율 및 석회화 영역의 평균 강도를 결정합니다. 대동맥을 스캔한 직후, 충분한 단백질 농도를 산출하기 위해 2-3개의 대동맥을 풀링합니다.
섭씨 37도에서 2 시간 동안 1.5 밀리리터의 소화액에 2-3 개의 웅덩이 된 대동맥을 배양합니다. 용액을 모으고 1, 000g에서 15 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거한다. 다음으로, 마이크로베시클을 제거하고, 상층액을 다시 33, 000 g에서 30분 동안 원심분리한다.
석회화 가능성에 대해 상청액을 수집하고 평가합니다. 원심분리에 의해 컨디셔닝된 수집된 배지로부터 세포 파편을 제거한 후, 수집된 상등액을 33, 000 g에서 30분 동안 회전시킨다. 상층액을 모아 새 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 세포외 소포 샘플에 1%의 300밀리몰 인산이수소나트륨을 추가하고 피펫팅으로 용액을 혼합합니다. 200 마이크로리터의 혼합물 용액을 96-웰 플레이트로 옮기고, 96-웰 플레이트를 섭씨 37도의 마이크로플레이트 판독기에서 인큐베이션한다. 1분마다 340나노미터의 파장에서 흡광도를 기록하도록 플레이트 리더를 설정합니다.
300 마이크로리터의 콜라겐 용액을 8-웰 챔버 유리의 각 웰에 피펫팅하고, 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 72시간 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 대조군으로서 300 마이크로리터의 DMEM을 웰에 첨가한다. 이전에 수집된 세포외 소포 배지 샘플 300마이크로리터를 나머지 웰에 추가하고, 앞서 설명한 바와 같이 6일 동안 배양합니다.
10일째에, 2.5 마이크로리터의 OsteoSense 및 DMEM 혼합물을 각 웰에 피펫팅하고, 24시간 동안 인큐베이션한다. 배양이 끝나면 도립 현미경을 사용하여 커버글라스 챔버의 바닥을 통해 OsteoSense 형광 필터가 있는 하이드로겔을 이미지화하거나 작동 거리가 긴 대물렌즈가 있는 상단에서 이미지화합니다. ImageJ에서 사용할 수 있는 입자 분석 옵션을 사용하여 석회화 횟수와 석회화 크기 및 수집된 이미지를 평가합니다.
그런 다음 Image(이미지)로 이동하여 Adjust(조정)를 선택하고 Threshold(임계값)를 클릭하여 OsteoSense 신호만 흰색으로 표시되도록 이미지를 이진화합니다. 그런 다음 분석(Analyze)을 사용하고 입자 분석(Analyze Particles) 명령을 클릭하여 이미지의 각 석회화에 대한 정보를 얻습니다. 분석된 각 이미지의 일관성을 위해 동일한 임계값 매개 변수를 사용합니다.
해부된 대동맥의 근적외선 광학 스캐너 영상은 대조군 마우스의 두 대동맥보다 만성 신장 질환이 있는 마우스의 대동맥 전체에서 더 높은 OsteoSense 신호를 보여주었습니다. pro-calcific 배지에서 배양된 혈관 평활근 세포로부터 얻은 컨디셔닝 배지는 대조군 배지보다 340 나노미터에서 더 높은 흡광도를 보였다. 흡광도 증가는 대조군 샘플에 비해 pro-calcific 샘플에서 1.5배 더 빠르게 발생했습니다.
pro-calcific 조건에서 배양 된 세포로부터의 컨디셔닝 된 배지는 미네랄 침전물을 함유했다. 대동맥을 미세 절개할 때는 대동맥 주변의 지방을 조심스럽게 절단하는 것이 중요합니다. 가능한 한 많은 대동맥을 분석하기를 원하지만 이것은 매우 지루할 수 있습니다.
EV가 분리되면 알칼리성 포스파타제 활성 분석 또는 면역체와 같은 추가 검사를 완료할 수 있습니다. 이 테스트는 EV에 존재하는 메커니즘과 단백질을 추가로 보여줍니다.
