Este protocolo proporciona un método que se puede utilizar para ayudar a evaluar y, en el futuro, ayudar a desarrollar tratamientos para la calcificación vascular, que es el predictor más importante de la enfermedad cardiovascular. La capacidad de aislar EVs nos permite estudiar más a fondo los mecanismos que conducen a la calcificación vascular y el cambio fenotípico de las células del músculo liso vascular. Esta técnica proporciona información sobre los mecanismos moleculares tempranos de la calcificación mediada por células del músculo liso vascular.
Comprender esto permite estudiar opciones terapéuticas para el mecanismo comprendido. Cualquier EV de interés se puede estudiar utilizando este método. No es exclusivo de las células del músculo liso vascular, los osteoblastos o la calcificación vascular.
Después de sacrificar al ratón, levante la piel con pinzas y haga una incisión en la línea media. Elimine cualquier exceso de piel o grasa. Luego retire los órganos reproductivos, la vejiga y la grasa fuera de la línea media.
Luego mueva los órganos gastrointestinales hacia el lado derecho y siga los intestinos en la línea media. Una vez encontrado, levante la línea media y extirpe el tracto gastrointestinal hasta el estómago. Extirpe los riñones levantándolos de la línea media.
Corte lo más cerca posible del riñón. Retire el hígado levantando los lóbulos y cortando lejos de la línea media. Luego perfundir el corazón y la aorta inyectando PBS frío en el ventrículo derecho con una jeringa de 10 mililitros.
Espere a que los pulmones se inflen y se vuelvan blancos. Extirpar los pulmones y cualquier exceso de diafragma o caja torácica. Para quitar el hueso, abra un par de tijeras y colóquelas en la región inferior del mouse por encima de la cola.
Corte hacia abajo, levante la columna vertebral de la piel y retire la grasa de los lados de la línea media. Una vez que la piel se desprende, extirpe la columna vertebral y los órganos intactos cortando justo por encima del corazón. Coloque la columna vertebral y los órganos intactos en un vaso de precipitados de PBS en el cubo de hielo si lo transporta a un estereoscopio.
Después de mover la columna vertebral y los órganos en el plato de disección, llénelo con PBS helado y fije la columna vertebral y la caja torácica con agujas. Bajo el microscopio de disección, levante el corazón con cuidado con pinzas y comience a cortar por encima de la columna vertebral y debajo de la aorta. Continúe esto hasta que se alcance la parte inferior de la columna vertebral.
Retire la columna vertebral del plato de disección y fije el corazón y cualquier grasa o músculo extraño. Comenzando desde el área justo debajo del corazón, identifique el esófago, la vena cava y la aorta. Extirpar el esófago y la vena cava para tener un campo visual claro de la aorta.
Usando las pinzas y tijeras de microdisección, comience a levantar el tejido adiposo y corte lo más cerca posible de la aorta. Continúe esto por la línea medial hasta que toda la aorta y las arterias femorales estén expuestas. En el corazón, retire todo el tejido adiposo exponiendo las tres ramas en el arco aórtico.
Retire la raíz aórtica del ventrículo izquierdo insertando las tijeras de microdisección en el ventrículo izquierdo y cortando el músculo que rodea la aorta. Una vez que la aorta está aislada y limpiada, obtenga imágenes de la aorta usando un escáner de infrarrojo cercano para visualizar la calcificación vascular. Utilizando el script personalizado de MATLAB, cuantifique la señal total del marcador de calcio normalizada al área total de la aorta explorada.
Dirija el MATLAB a la ubicación de los archivos TIF desde el escaneo de infrarrojo cercano de las aortas, abra los archivos individuales y extraiga los valores de intensidad de píxeles de los archivos TIF. Seleccione la aorta con la mayor calcificación como escala máxima en la imagen mapeada en color. Cuando aparezca en la ventana el comando Cuántos especímenes hay en la imagen, introduzca el número de aortas de la imagen actual y seleccione cada aorta una por una.
Una vez seleccionada una aorta, MATLAB creará imágenes binarias con una máscara del área total y el área calcificada de la aorta. Los valores de estas imágenes enmascaradas se utilizan para determinar el área calcificada total, el área total de la aorta, el área porcentual positiva para calcificación y la intensidad media del área calcificada. Inmediatamente después de escanear las aortas, agrupe de dos a tres aortas para producir una concentración suficiente de proteínas.
Incubar de dos a tres aortas agrupadas en 1,5 mililitros de solución digestiva durante dos horas a 37 grados centígrados. Recoja la solución y centrifugar a 1, 000 g durante 15 minutos para eliminar los restos celulares. A continuación, para eliminar las microvesículas, centrifugar el sobrenadante nuevamente durante 30 minutos a 33, 000 g.
Recolectar y evaluar el sobrenadante para determinar el potencial de calcificación. Después de eliminar los restos celulares del medio recogido acondicionado por centrifugación, gire el sobrenadante recogido a 33, 000 g durante 30 minutos. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo nuevo.
Luego agregue el 1% de 300 milimolares de dihidrógeno de sodio fosfato a las muestras de vesículas extracelulares y mezcle la solución por pipeteo. Transfiera 200 microlitros de la solución de mezcla a una placa de 96 pocillos e incube la placa de 96 pocillos en el lector de microplacas a 37 grados centígrados. Configure el lector de placas para registrar la absorbancia a una longitud de onda de 340 nanómetros cada minuto.
Pipetear 300 microlitros de la solución de colágeno en cada pocillo de un vidrio de cámara de ocho pocillos, e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Después de la incubación, agregue 300 microlitros de DMEM como control en los pozos. Agregue 300 microlitros de las muestras de medio vesicular extracelular recolectadas previamente a los pocillos restantes e incube durante seis días, como se demostró anteriormente.
En el día 10, pipetear 2,5 microlitros de la mezcla OsteoSense y DMEM en cada pocillo e incubar durante 24 horas. Al final de la incubación, obtenga una imagen de los hidrogeles con filtros para la fluorescencia OsteoSense a través de la parte inferior de una cámara de vidrio de cubierta utilizando un microscopio invertido, o desde la parte superior con un objetivo de larga distancia de trabajo. Evalúe el número de calcificaciones y el tamaño de calcificación y las imágenes recopiladas utilizando las opciones de análisis de partículas disponibles en ImageJ.
A continuación, vaya a Imagen, seleccione Ajustar y haga clic en Umbral para binarizar las imágenes, de modo que solo la señal de OsteoSense aparezca en blanco. A continuación, utilice el comando Analizar y haga clic en Analizar partículas para obtener información para cada calcificación de la imagen. Utilice los mismos parámetros de umbral para la coherencia de cada imagen analizada.
Las imágenes del escáner óptico de infrarrojo cercano de las aortas disecadas mostraron una señal OsteoSense más alta en toda la aorta de un ratón con enfermedad renal crónica que las dos aortas de ratones de control. El medio condicionado obtenido a partir de células del músculo liso vascular cultivadas en un medio procalcificado mostró una mayor absorbancia a 340 nanómetros que el medio control. El aumento de absorbancia ocurrió 1,5 veces más rápido en la muestra procalcificada en comparación con una muestra de control.
El medio acondicionado de células cultivadas en condiciones pro-calcificadas contenía depósitos minerales. Al micro-diseccionar la aorta, es importante cortar la grasa que rodea la aorta cuidadosamente. Desea analizar la mayor cantidad posible de aorta, pero esto puede ser bastante tedioso.
Una vez que se aíslan los vehículos eléctricos, se podrían completar pruebas adicionales, como un ensayo de actividad de fosfatasa alcalina o un cuerpo inmunológico. Estas pruebas mostrarían aún más los mecanismos y proteínas presentes en los EV.
