Este protocolo fornece um método que pode ser usado para ajudar a avaliar e, no futuro, ajudar a desenvolver tratamentos para a calcificação vascular, que é o preditor mais significativo de doença cardiovascular. A capacidade de isolar EVs nos permite estudar mais profundamente os mecanismos que levam à calcificação vascular e à mudança fenotípica das células musculares lisas vasculares. Esta técnica fornece informações sobre os mecanismos moleculares iniciais da calcificação mediada por células musculares lisas vasculares.
Entender isso permite que as opções terapêuticas sejam estudadas para o mecanismo compreendido. Quaisquer EVs de interesse podem ser estudados usando este método. Não é exclusivo das células musculares lisas vasculares, osteoblastos ou calcificação vascular.
Depois de eutanasiar o rato, levante a pele usando uma pinça e faça uma incisão na linha média. Remova qualquer excesso de pele ou gordura. Em seguida, remova os órgãos reprodutivos, bexiga e gordura fora da linha média.
Em seguida, mova os órgãos gastrointestinais para o lado direito e siga os intestinos na linha média. Uma vez encontrado, levante a linha média e excise o trato gastrointestinal até o estômago. Excise os rins, levantando-os para longe da linha média.
Corte o mais próximo possível do rim. Remova o fígado levantando os lóbulos e cortando a linha média. Em seguida, perfundir o coração e a aorta injetando PBS frio no ventrículo direito usando uma seringa de 10 mililitros.
Espere os pulmões inflarem e fique branco. Remova os pulmões e qualquer excesso de diafragma, ou caixa torácica. Para remover o osso, abra uma tesoura e coloque-a na região inferior do mouse acima da cauda.
Corte para baixo, levante a coluna da pele e remova a gordura dos lados da linha média. Uma vez que a pele é destacada, excise a coluna vertebral e os órgãos intactos, cortando logo acima do coração. Coloque a coluna vertebral e os órgãos intactos em um copo de PBS no balde de gelo se transportar para um estereoscópio.
Depois de mover a coluna vertebral e os órgãos para o prato de dissecação, preencha-o com PBS gelado e prenda a coluna vertebral e a caixa torácica usando agulhas. Sob o microscópio de dissecção, levante o coração cuidadosamente usando uma pinça e comece a cortar acima da coluna vertebral e abaixo da aorta. Continue até que o fundo da coluna vertebral seja atingido.
Remova a coluna vertebral do prato dissecante e fixe o coração e qualquer gordura ou músculo estranho. Começando pela área logo abaixo do coração, identifique o esôfago, a veia cava e a aorta. Remova o esôfago e a veia cava para ter um campo visual claro da aorta.
Usando a pinça de micro-dissecção e tesoura, comece a levantar o tecido adiposo e corte o mais próximo possível da aorta. Continue isso pela linha medial até que toda a aorta e as artérias femorais estejam expostas. No coração, remova todo o tecido adiposo expondo os três ramos no arco aórtico.
Remova a raiz da aorta do ventrículo esquerdo inserindo a tesoura de microdissecção no ventrículo esquerdo e cortando o músculo ao redor da aorta. Uma vez que a aorta é isolada e limpa, a imagem da aorta usando um scanner infravermelho próximo para visualizar a calcificação vascular. Usando o script MATLAB personalizado, quantifique o sinal total do marcador de cálcio normalizado para a área total da aorta digitalizada.
Direcione o MATLAB para o local dos arquivos TIF a partir da varredura de infravermelho próximo dos aortas, abra os arquivos individuais e extraia os valores de intensidade de pixel dos arquivos TIF. Selecione a aorta com a maior calcificação como a escala máxima na imagem mapeada a cores. Quando o comando, Quantos espécimes estão na imagem, aparecer na janela, insira o número de aortas na imagem atual e selecione cada aorta uma a uma.
Uma vez que uma aorta é selecionada, o MATLAB criará imagens binárias com uma máscara da área total e da área calcificada da aorta. Os valores dessas imagens mascaradas são então usados para determinar a área total calcificada, a área total da aorta, a porcentagem de área positiva para calcificação e a intensidade média da área calcificada. Imediatamente após a varredura das aortas, agrupe duas a três aortas para produzir uma concentração suficiente de proteína.
Incubar duas a três aortas agrupadas em 1,5 mililitros de solução digestiva por duas horas a 37 graus Celsius. Recolher a solução e centrifugar a 1 000 g durante 15 minutos para remover os detritos celulares. Em seguida, para remover as microvesículas, centrifugar o sobrenadante novamente por 30 minutos a 33.000 g.
Coletar e avaliar o sobrenadante para o potencial de calcificação. Após a remoção dos detritos celulares do meio condicionado coletado por centrifugação, girar o sobrenadante coletado a 33.000 g por 30 minutos. Colete o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo.
Em seguida, adicione 1% de 300 milimolares de dihidrogenofosfato de sódio às amostras de vesículas extracelulares e misture a solução por pipetagem. Transfira 200 microlitros da solução de mistura para uma placa de 96 poços e incube a placa de 96 poços no leitor de microplacas a 37 graus Celsius. Configure o leitor de placas para registrar a absorvância em um comprimento de onda de 340 nanômetros a cada um minuto.
Pipetar 300 microlitros da solução de colágeno em cada poço de um vidro de câmara de oito poços e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Após a incubação, adicione 300 microlitros de DMEM como controle nos poços. Adicionar 300 microlitros das amostras de meio vesicular extracelular coletadas previamente aos poços restantes e incubar por seis dias, como demonstrado anteriormente.
No 10º dia, pipetar 2,5 microlitros da mistura OsteoSense e DMEM em cada poço e incubar por 24 horas. No final da incubação, imagine os hidrogéis com filtros para fluorescência OsteoSense através da parte inferior de uma câmara de vidro de cobertura usando um microscópio invertido, ou do topo com uma objetiva de longa distância de trabalho. Avalie o número de calcificações e o tamanho da calcificação e as imagens coletadas usando as opções de análise de partículas disponíveis no ImageJ.
Em seguida, navegue até Imagem, selecione Ajustar e clique em Limiar para binarizizar as imagens, de modo que apenas o sinal OsteoSense apareça branco. Em seguida, use o comando Analisar e clique em Analisar partículas para obter informações para cada calcificação na imagem. Use os mesmos parâmetros de limite para consistência para cada imagem analisada.
A imagem do scanner óptico infravermelho próximo das aortas dissecadas mostrou um sinal OsteoSense maior em toda a aorta de um rato com doença renal crônica do que as duas aortas de camundongos controle. O meio condicionado obtido a partir de células musculares lisas vasculares cultivadas em meio pró-calcifico apresentou maior absorvância a 340 nanômetros que o meio controle. O aumento da absorbância ocorreu 1,5 vezes mais rápido na amostra pró-calcífica em comparação com uma amostra controle.
O meio condicionado de células cultivadas em condições pró-calcificas continha depósitos minerais. Ao micro-dissecar a aorta, é importante cortar a gordura ao redor da aorta com cuidado. Você quer o máximo possível da aorta para analisar, mas isso pode ser bastante tedioso.
Uma vez que os EVs são isolados, testes adicionais, como um ensaio de atividade de fosfatase alcalina, ou imunocorpo podem ser concluídos. Esses testes mostrariam ainda mais os mecanismos e proteínas presentes nos VEs.
