DFは、博士のフェローシップへのNSFのブリッジによってサポートされています。本研究で使用した顕微鏡は、コロラド州立大学から顕微鏡イメージングネットワークコアインフラ助成金によって部分的にサポートされています。著者の研究室でのクラスリンアダプターの作業は、CSUスタートアップ資金と米国心臓協会賞SDへ09SDG2280525でサポートされています

1。 SLA1遺伝子にGFPのタグと選択マーカーの取り込み SLA1遺伝子のオープンリーディングフレーム（Sla1p C -末端）の3&#39;末端に直接GFPのタグを融合させると同時に、E.との遺伝子をマークするためにLongtine法17を適用するG418選択を可能にする大腸菌館r遺伝子。 <ol><li>フォワード、5&#39; - CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC：鋳型としてプラスミドpFA6a - GFP（S65T）- kanMX6 18および以下のプライマーを用いたPCRによりDNA断片を生成するCCC GGG TTA ATT AA - 3&#39;、およびリバース、5&#39; - CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC - 3&#39;。下線の配列は、直前の（フォワードプライマー）とストップコドン（リバースプライマー）を以下のSLA1遺伝子の特定のセグメントに対応しています。 DNA精製に続いて​​アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を分離する。 </li><li> 50ミリリットル文化S.を準備出芽酵母 SEY6210株（MAΤαURA3 - 52、LEU2 - 3、112 HIS3 -Δ200、TRP1 -Δ901、LYS2 - 801、SUC2 · -Δ9GAL - MEL）YPD 19は 、初期対数増殖期（OD 600 = 0.2〜0.6）で成長。 2000 × gで3分間、室温でスピン、滅菌水で2回洗浄。 </li><li>酢酸リチウム手順20を用いて細胞に、ステップ1で得られたPCRフラグメントを変換します。 1ミリリットルYPD、30で4時間インキュベートしますシェーカーにCを追加し、1 mlの滅菌水で細胞を洗浄。 </li><li> 2〜3日間30℃でインキュベートしてG418耐性形質転換体、を選択するためにYPD - G418プレート上で細胞を広げる。 YPD - G418プレート上にコロニーとストリーク、それらを選択してください。 </li><li>コロニーPCRを用いて、GFP館モジュールが正しく相同組換えによりSLA1遺伝子配列に統合された形質転換体を識別する。 SLA1オープンリーディングフレームとGFP館モジュール内のアニールその逆方向プライマー内でアニールし、そのフォワードプライマーを使用してください。 PCR産物が予想される大きさを持っているし、シークエンシングにより確認するコロニーを特定する。 </li><li>彼らはGFP蛍光を持って確認するために蛍光顕微鏡でコロニーを選別する。 </li></ol> 2。 SLA1遺伝子の変異体クラスリンボックス（VCB）の変異<ol><li> 2段階のアプローチ15次のSLA1遺伝子（ヌクレオチド2407から2415）でAAALQの突然変異にLLDLQをご紹介。 </li><li>最初に、PCRによってSLA1ヌクレオチド1207から1410と2427から2589を増幅し、それぞれ、pBluescriptKS中のNotI / BamHIおよびEcoRI / SalI部位にフラグメントをクローニングする。 </li><li>をBamHI / EcoRI部位URA3を含むPCRフラグメントにサブクローン。 </li><li>をNotI / SalIで開裂得られたプラスミドは、ゲル精製によって、そして第1部で生成されたSla1 - GFP株に酢酸リチウム形質転換により、それを導入、またはTVY614（MATA URA3 - 52 LEU2 - 3112 HIS3 -Δ200TRP1にURA3断片を分離-Δ901LYS2 - 801 SUC2 -Δ9PEP4：：LEU2 PRB1：：HISG PRC1：：HIS3）21。 </li><li>ウラシルを欠く補足SDプレート上で細胞を広げる。裏+コロニーはVCBフラグメントを置換する適切に統合されたURA3を含むことをコロニーPCRとシークエンシングにより確認してください。 </li><li>第二段階で、サブクローンSLA1ヌクレオチドpBluescriptKS中のNotI / SalI部位に1207年から2589年。クイックチェンジ- XLの部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を使用して、AAALQにVCB残LLDLQを変異。シークエンシングにより確認してください。 </li><li>クリーブBsgI /阿給で得られた構築物、およびゲル精製により断片を含む変異体VCBを分離する。パート2.3で得られた株にpRS313（HIS3）22とBsgI /阿給フラグメントをCotransform。 </li><li>ヒスチジンを欠く補足SDプレート上で細胞を広げる。レプリカプレート彼+コロニーのため、変異体配列は、URA3を置換した細胞を同定するために、5 fluorotic酸、回生AAALQの突然変異にLLDLQを含むsla1遺伝子（sla1 AAA）を含む寒天培地上に。コロニーPCRとシークエンシングにより確認してください。 </li></ol> 3。蛍光顕微鏡<ol><li> Sla1 - GFPとsla1 AAA - GFPは、OD 600 = 0.1から0.4に達するまで30℃で補ったSDメディアを4ml ·ダークでローテータのCのパート1と2で生成された酵母株を成長する。室温で1分間4000 × gで遠心機で文化の1mlをスピン。上清の950μlを捨てる。 ·残留液（50μl程度）で細胞を再懸濁します。 </li><li>ガラスのカバースリップと顕微鏡スライドとカバー上に細胞懸濁液の沈殿物3μlの。光からサンプルを保護します。 </li><li>マウントは回転、ディスク共焦点顕微鏡の100倍の油浸対物レンズにスライドさせます。 </li><li> GFPの蛍光を励起して検出するために適切なフィルタを使用して、明視野または488 nmのレーザーを使用してセルの正しい焦点面の位置を確認します。 </li><li>少なくとも500ミリ秒の露光時間（または適切な値）を持つ細胞でSla1 - GFPとsla1 AAA - GFPのタイムラプス画像をキャプチャ150秒間に毎秒1画像のn個の間隔。期待される結果：punctaeラベル付けGFPは、細胞の膜を制限するの内面に表示されます数秒間持続する、と信号がすぐに（分解コートを示す）が消えるように、セルの中央に向かって移動します。 </li><li>スポットが、表示数秒間維持し、消滅する見されている画像の部分を選択します。タイムラプス画像の各フレームの画像のこのセクションをトリミング。 </li><li>経過時間に対応する軸に沿ってフレームを合わせて150秒のタイムアウト経過の画像の各フレームの画像のこのセクションを表すカイモグラフを生成します。 </li><li>スポットがキモグラフに存在する秒数（コマ撮りのフレーム）に基づいて、各スポットの持続時間を計算する。各スポットは、それが消えているように、セルの内部に向かって&quot;曲線&quot;、コートのエンドサイトーシスと分解を反映する必要があることに注意。 </li><li> sla1 AAA - GFPと野生型Sla1 - GFPを比較。結果は統計的に有意であるかどうかを判断するために繰り返します。期待される結果：sla1 AAA - GFPのスポットが有意に長く（約80秒）被膜形成15の欠陥を示す野生型（〜30秒）よりも持続する。 </li></ol> 4。酵母細胞質抽出液と総細胞抽出液の調製<ol><li>このようなTVY614 21などの適切な酵母菌株、とYPD 3リットルを接種し、30で成長OD 600 = 1-2に到達するまでシェーカーインキュベーター内° C。 </li><li> 3700 × gで20分間室温で酵母培養液を遠心してください。 、上清を捨て、滅菌水の3〜5 mlを追加し、ペレットが完全に再懸濁されるまで上下にピペッティングし。 </li><li> 250mlのプラスチックビーカーに液体窒素中〜150mlを注ぐ。凍結ペレットの凝集を避けるために、円を描くように液体窒素中に滴下して酵母を急速冷凍。必要に応じてより多くの液体窒素を追加し、ペレットを融解させてはいけない。 </li><li>その中に液体窒素を注ぐことによってステンレス鋼ブレンダー容器を冷やす。液体窒素がほぼ完全に蒸発させる。コー​​ルドブレンダー容器に凍結酵母ペレットを追加。冷たいゴム栓でブレンダー容器を閉じ、10秒間酵母のペレットを挽く。内容物を混合し、二回粉砕工程を繰り返すコンテナ3-4回転倒混和します。地面凍結酵母は粉のような外観を持つことになります。 </li><li>液体窒素で漏斗及び50 mlコニカルチューブを冷やします。寒い漏斗を使用して、管にアース酵母を転送する。凍土の酵母は、-80 ° Cまたはすぐに使用でストアすることができます。 </li><li> GST -融合タンパク質のアフィニティーアッセイ（その5）、重量凍土3gを15mlコニカルチューブにTVY614酵母と室温の緩衝液3mlに再懸ための細胞質抽出液を得た（10mMのHEPES、pH 7.0の、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma）を含む150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのDTT）。 </li><li>キャップと完全に融解し、氷上に置くまで、チューブを数回転倒。 </li><li> 4に抽出液を超遠心°30万x gで20分間を慎重にペレットが剥がれないようにピペットを用いてコニカルチューブに上清（細胞質抽出）を転送する。氷上で細胞質抽出液を保管してください。 </li><li>これは、ビーズをペッティング容易にするためにチップの先端をカットするのに便利です緩衝液Aで50％（v / v）のグルタチオン - セファローススラリー100μlを加え。 4℃で回転させ° Cで1​​5分間、4℃で遠心分離によりビーズをスピンダウンで2 1,000 × gで分、および新しいチューブに上清（細胞質抽出物）を転送するためのC。予備入力の制御のための抽出物を50μl。 </li><li>共免疫沈降実験（その6）のための全細胞抽出物を得るために、ひずみTVY614（WT SLA1）、TVY614バックグラウンドで2部で生成されたAAALQの突然変異にLLDLQを運ぶsla1 AAAひずみ、および削除を運ぶsla1菌株を使用してくださいGPY3130 23などのようなSLA1遺伝子。重量2コニカルチューブに対応する凍土の酵母のgと室温の緩衝液2mlで再懸濁します、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma社）、2％トリトンX - 100を含む。 </li><li>キャップと完全に融解し、定期的に反転して混合、10分間氷上でインキュベートするまで、チューブを数回転倒。 </li><li> 4でマイクロチューブとスピンに素材を転送° C 16000 XG（微量遠心機で最高速度）で15分間。慎重にペレットが剥がれないようにピペットを用いて氷上でコニカルチューブに上清（総細胞抽出液）を転送する。 </li><li>緩衝液Aで50％（v / v）の蛋白質A -セファローススラリー100μlを追加する4時に回し℃で15分間、2 1,000 × gで分、および転送のためにスピンダウン4の遠心分離によりビーズ° CのCを上清（全抽出物）を新しいチューブへ。予備入力の制御のための抽出物を50μl。 </li></ol> 5。 GST -融合タンパク質のアフィニティーアッセイ<ol><li> PCRフラグメントcontainiによって増幅NG Sla1pバリアントクラスリンボックス（VCB）（残基803から807）は、をpGEX - 5X - VCBを得るためにをpGEX - 5Xにそれを複製する。シークエンシングにより確認してください。 </li><li>テンプレートとクイックチェンジ- XLの部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene社製）とをpGEX - 5X - VCBを使用して、をpGEX - 5X - vCBmut取得するためにAAALQにVCB残基をLLDLQ変異。シークエンシングにより確認してください。 </li><li>エクスプレスGSTとの融合蛋白質GST - VCBとE.におけるGST - vCBmut 大腸菌 （BL21 DE3）は、還元型グルタチオンで ​​ビーズからグルタチオン-セファロース、溶出を用いて精製し、PBSに対して透析し、タンパク質濃度を決定する。 </li><li>ラベル3マイクロ遠心チューブ：GST、GST - VCB、およびGST - vCBmut、そして1mlのPBS、バッファ内の50％（v / v）のグルタチオン - セファローススラリー30μlのdialized GST、GSTの、および50μg/mlを追加する- VCB、またはGST - vCBmutの融合タンパク質。 </li><li>結合を可能にするために30分間、室温で回転させます。 </li><li>パート4で説明したように調製 - - 各チューブに酵母細胞質抽出液の1 mlのバッファーAでビーズをPBSで2回と1回洗浄する。 </li><li> 、5000ペレットビーズにxgでチューブを4℃で1時間C、スピン10秒を回転させ上清を捨てる、とすぐにバッファAとバッファを使用してビーズを含む0.1％トリトンX - 100、および1時間を3回洗浄</li><li>ビーズ1つのより多くの時間をスピンダウンし、できるだけ多くの液体を除去ゲルローディングチップを使用して。この時点でサンプルは後で続行するには-20℃で保存することができます。 </li><li> 96でインキュベート各チューブに2倍Laemmliサンプルバッファー15μlの、℃で5分間を、追加し、5,000 × gで10秒スピン</li><li>クラスリン重鎖に対する抗体を用いたイムノブロットでサンプルを分析する。期待される結果：クラスリンが出ていて、GSTまたはGST - vCBmutにGST - VCBに結合する。また、GST融合タンパク質の同様の負荷を確認するためにSDS - PAGEでサンプルを分析する。 </li></ol> 6。共免疫沈降アッセイ<ol><li>ラベル3マイクロ遠心チューブ：WT（野生型SLA1）、sla1 AAA、およびsla1Δ、そして1mlのPBSを加える、バッファ内の50％（v / v）のタンパク質-セファローススラリー液30μl、および2μgのウサギ抗Sla1p抗体。 </li><li> 30分間室温で回転させます。 </li><li>含む緩衝液1％トリトンX - 100を含むPBSと1時間で二回ビーズを洗浄する。 </li><li> SLA1、sla1 AAA、およびsla1Δ：パート4で製造した対応する合計酵母抽出物の1 mlの。 4℃で1時間を回転させる</li><li>スピン10秒は5,000で、ペレット、ビーズにXGの上清を捨てる、とすぐにバッファでビーズを3回洗浄を含む0.1％のTriton X - 100、および緩衝液Aで1時間</li><li>ビーズ1つのより多くの時間をスピンダウンし、できるだけ多くの液体を除去ゲルローディングチップを使用して。この時点でサンプルは後で続行するには-20℃で保存することができます。 </li><li> 96でインキュベート各チューブに2倍Laemmliサンプルバッファー15μlの、℃で5分間を、追加し、5,000 × gで10秒スピン</li><li>クラスリン重鎖に対する抗体を用いたイムノブロットでサンプルを分析する。期待される結果：クラスリンsla1 AAA、またはsla1Δサンプルのではなく、野生型Sla1pと共免疫沈降物。 </li></ol> 7。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="図1" /> 図1生細胞の蛍光顕微鏡によるエンドサイトーシスのサイトでSla1pクラスリンアダプターの分析。 Sla1 - GFPまたはAAALQの突然変異にLLDLQを運ぶsla1 AAA - GFPを発現する酵母細胞の映像と、対応するkymographs（右）から一つのフレーム（左）。野生型とSla1 - GFP変異体の両方は、内因性SLA1遺伝子座から発現させた。エンドサイトーシスのサイトでは、細胞の周辺部（左画像）で配布明るい点として観察されています。白い線の間の領域は、kymographsが生成された領域に相当する。動画は1フレーム/秒のフレームレートで撮影されました。野生型（SLA1）と比較してAAALQ変異体へLLDLQ（sla1 AAA）でSla1 - GFPの長い寿命に注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="図2" /> 図2クラスリンとSla1p -バリアントクラスリンボックス間の物理的相互作用。 GSTはグルタチオンセファロースビーズに結合してから野生細胞質ゾル抽出物とインキュベートされたシーケンスLLDLQ（GST - VCB）、対応するAAALQ変異体（GST - vCBmut）、またはGST単独（GST）を含むフラグメントaa798 - 813をSla1pに融合酵母細胞のように入力します。関連するタンパク質がクラスリン重鎖のために（IB）イムノブロッティングにより溶出し、分析した。

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利害の衝突は宣言されません。

クラスリン被覆小胞（CCV）は、 トランスゴルジネットワークからエンドサイトーシスおよびトランスポートに参加し、真核細胞生物学の基礎となる保存経路をエンドソーム。このメソッドは用紙に記載されてのアプローチは、アダプタータンパク質とクラスリンとの間の特定の相互作用において、CCVの形成に関与する分子メカニズムを研究するために便利です。 GST -融合タンパク質の...

<table border="1"><th>材料</th><th>会社</th><tbody><tr><td>クイックチェンジ- XL部位特異的突然変異誘発キット</td><td>ストラタジーン</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>シグマ</td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

主要なエンドサイトーシス経路は、細胞表面からの輸送貨物は1-6エンドソームにいるクラスリン被覆小胞（CCVS）の形成を開始します。 CCVSは、そのクラスリンコート小胞の膜の多面体格子によって区別し、機械的な足場として機能している。クラスリンコートは個々のクラスリンtriskelionの複数形、三の重三軽鎖サブユニット7,8から構成されるクラスリンの可溶性形態から小胞形成の間に組み立てられます。三脚ともえ紋が直接細胞膜に結合する能力を持っていないため、クラスリン結合アダプタは、脂質および/ ​​または膜タンパク質9で会合を介して膜に成形クラスリン格子をリンクするために重要です。アダプタには、パッケージの膜貫通タンパク質のような受容体などの貨物、、とお互いに、CCVの形成機構9の他のコンポーネントとやり取りすることができます。 20以上のクラスリンアダプターは、記載されているいくつかは、クラスリン依存性エンドサイトーシスに関与していると他の人は、トランスゴルジネットワークに局在または9をエンドソーム。 HIP1R（酵母Sla2p）を除いて、すべての既知のクラスリンアダプターは、クラスリン重鎖9のN末端​​-プロペラドメインに結合する。クラスリンアダプターの構造化されていない柔軟なリンカーで接続された折りたたまれたドメインで構成されるモジュラータンパク質である。これらのリンカー領域内で、短い結合モチーフはクラスリンのN -末端ドメインまたは小胞の形成機構9の他のコンポーネントとの相互作用を媒介する。二つの異なるクラスリン結合モチーフが定義されています：クラスリンボックスとW -ボックス9。コンセンサスクラスリンボックスシーケンスはもともとLとして定義されていた[L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10しかし、変種、その後11を発見されている。 W -ボックスは、シーケンスPWxxW（xは任意の残留物である）に準拠しています。 Sla1pは（アクチン結合タンパク質- 1で合成致死）もともとアクチン関連タンパク質として同定し、酵母細胞12のエンドサイトーシスのサイトで通常のアクチン細胞骨格の構造とダイナミクスのために必要ですれました。 Sla1pもNPFxDエンドサイトーシスのソートの信号を結合し、NPFxD信号13,14を担持する貨物のエンドサイトーシスに重要である。最近では、Sla1pはクラスリンボックス、LLDLQに似てモチーフを介してクラスリン結合することが実証された、バリアントクラスリンボックス（VCB）と呼ばれ、エンドサイトーシスのクラスリンアダプター15として機能する。さらに、Sla1pは生細胞の蛍光顕微鏡の研究16におけるエンドサイトーシスのコートに広く使用されているマーカーとなっています。ここでは、アダプタクラスリンの相互作用の研究のためのアプローチを記述するモデルとしてSla1pを使用してください。我々は、生細胞の蛍光顕微鏡に焦点を当てる、ダウンGST -プル、および共免疫沈降法。

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

クラスリン依存性エンドサイトーシスは、貨物の選択とクラスリン被覆のアセンブリを調整するアダプタータンパク質に依存します。ここではモデルとして酵母エンドサイトーシスのアダプタータンパク質のSla1pを使用してアダプタクラスリンの物理的相互作用および生細胞イメージングのアプローチを研究するための手順を説明します。

in vivoおよびアダプター、クラスリンの相互作用のin vitro試験

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

14.4K ビュー.  Colorado State University. クラスリン依存性エンドサイトーシスは、貨物の選択とクラスリン被覆のアセンブリを調整するアダプタータンパク質に依存します。ここではモデルとして酵母エンドサイトーシスのアダプタータンパク質のSla1pを使用してアダプタクラスリンの物理的相互作用および生細胞イメージングのアプローチを研究するための手順を説明します。

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In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

in vitroおよびヒト胚性幹細胞のin vivoでの生物発光レポーター遺伝子イメージングの

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

生物学

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

細胞質DNAセンシング経路の刺激<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an efficient inducible mechanism to isolate the fungal haustoria from the plant cell protoplast. Conversely, pectin, one of the polymeric components of the cell wall, is a target of several pectolytic enzymes in necrotrophic interactions. Here, a protocol to detect pectin and fungal hyphae through optical microscopy is presented. The pectin-rich encapsulation in the cells of coffee leaves infected by the rust fungus Hemileia vastatrix and the mesophyll cell wall modification induced by Cercospora coffeicola are investigated. Lesioned leaf samples were fixed with the Karnovsky solution, dehydrated, and embedded in glycol methacrylate for 2-4 days. All steps were followed by vacuum-pumping to remove air in the intercellular spaces and improve the embedding process. The embedded blocks were sectioned into 5-7 &#181;m thick sections, which were deposited on a glass slide covered with water and subsequently heated at 40 &#176;C for 30 min. Next, the slides were double-stained with 5% cotton blue in lactophenol to detect the fungus and 0.05% ruthenium red in water to detect pectin (acidic groups of polyuronic acids of pectin). Fungal haustoria of Hemileia vastatrix were found to be encapsulated by pectin. In coffee cercosporiosis, mesophyll cells exhibited dissolution of cell walls, and intercellular hyphae and conidiophores were observed. The method presented here is effective to detect a pectin-associated response in the plant-fungi interaction.

This protocol describes a microscopical method to detect pectin in coffee-fungus interaction.

植物-真菌相互作用におけるペクチンを検出する二重染色法

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; however, there are currently no treatment or therapeutic options for vascular calcification. Calcification begins within specialized extracellular vesicles (EVs), which serve as nucleating foci by aggregating calcium and phosphate ions. This protocol describes methods for obtaining and assessing calcification in murine aortas and analyzing the associated extracted EVs. First, gross dissection of the mouse is performed to collect any relevant organs, such as the kidneys, liver, and lungs. Then, the murine aorta is isolated and excised from the aortic root to the femoral artery. Two to three aortas are then pooled and incubated in a digestive solution before undergoing ultracentrifugation to isolate the EVs of interest. Next, the mineralization potential of the EVs is determined through incubation in a high-phosphate solution and measuring the light absorbance at a wavelength of 340 nm. Finally, collagen hydrogels are used to observe the calcified mineral formation and maturation produced by the EVs in vitro.

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

This paper presents the methodology for obtaining and assessing vascular calcification by isolating murine aortas followed by extracting calcified extracellular vesicles to observe the mineralization potential.

in vitro および in vivo モデルを用いた細胞外小胞媒介血管石灰化の解析

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

脱細胞化による骨格筋脂肪浸潤の定量化

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

著者スポットライト:骨格筋脂肪浸潤の脱細胞化に基づく定量化  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.