前臨床薬物検査のための卵巣癌患者由来オルガノイドモデル

このプロトコルは、患者由来の卵巣癌オルガノイドを使用して薬物生存率アッセイを実施するための低コストの方法を説明しています。この技術の主な利点は、低コストですぐに入手できる材料と実験装置を使用することです。この方法は、高価なハイスループット薬物スクリーニングを行う前に使用できます。

この方法は、患者由来の卵巣癌オルガノイドにおける薬物生存率アッセイの実施を扱っていますが、マウス由来のものを含むあらゆるオルガノイド系に適用できます。まず、基底膜抽出物またはオルガノイドを含むBMEを明視野顕微鏡で観察し、70〜90%のコンフルエント性を確保します。ピペットを使用して、オルガノイドを含むウェルに1〜2ミリリットルの予熱したベース培地を加え、オルガノイドをピペッティングして機械的に解離します。

オルガノイド懸濁液全体を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、チューブを5〜10秒間ボルテックスして、細胞をさらに分解します。次に、細胞を1, 107Gで室温で5分間遠心分離します。シングルチャンネルピペットを使用して、上清を吸引して廃棄します。

摂氏37度に予熱した1ミリリットルのオルガノイド解離試薬にペレットを再懸濁し、懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを摂氏37度で7分間インキュベートします。次に、細胞懸濁液中の結果を1, 107 Gで室温で5分間遠心分離します。

上清を廃棄した後、細胞ペレットを1ミリリットルの予熱したベース培地に再懸濁します。ベース培地とBMEの混合物で細胞を再構成し、10マイクロリットルあたり20、000細胞の最終濃度を維持します。黒色不透明の96ウェルプレートのウェルあたり、再懸濁した細胞の3マイクロリットルの液滴を1つプレーティングします。

プレートを細胞培養インキュベーターで摂氏37度で15分間インキュベートします。最後に、100マイクロリットルの予熱した高度なオルガノイド培地を各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で24〜72時間インキュベートします。オルガノイドをプレーティングしてから2日後に薬物治療を行います。

薬物治療の7日後にオルガノイドの生存率アッセイを実施します。各ウェルに100マイクロリットルの生存率アッセイ試薬を添加し、総容量を200マイクロリットルにし、プレートを80RPMで5分間振とうします。その後、プレートを室温でさらに25分間インキュベートします。

その間、生物発光プレートリーダーのスイッチを入れ、視線制御ソフトウェアを開きます。ナビゲートして機器に接続します」Infinite 200Proを選択します「発光を選択」とデフォルトのスクリプト「次に、ドロップダウンメニューからBD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black」を選択します。attenuationをnoneとして割り当てます。

積分時間は1000ミリ秒、整定時間は0ミリ秒です。最後に、プレートのカバーを外し、プレートリーダーにセットし、「開始」を押して開始します。プロトコルで使用した2つの異なる患者由来オルガノイド(PDO)について明視野画像を取得しました。

PDO1は腫瘍生検に由来し、PDO2は腹水に由来する。生存率アッセイの結果、PDO1とPDO2の両方をさまざまな濃度のカルボプラチンで処理した後の生細胞の割合が明らかになりました。計算された成長率(GR値)を対応するカルボプラチン濃度に対してプロットしたところ、GR指標により、PDO1のGR50値はPDO2のGR50値よりもはるかに高いことが明らかになりました。

これは、PDO1がプラチナ化学療法に対してより耐性があることを示しました プレーティング中、細胞懸濁液の3マイクロリットルの液滴をウェルの中央に直接配置することが重要です。液滴をウェルの端に近づけると、液滴が潰れ、アッセイ結果に影響を与える可能性があります。