ヒト患者由来オルガノイドは、患者の多様性と腫瘍の細胞不均一性の両方を表す3次元in vitroモデルシステムです。このプロトコルとビデオデモンストレーションは、患者由来の乳房腫瘍と正常なオルガノイドを確立するための詳細な実践的なガイドを提供します。患者由来の乳房腫瘍オルガノイドはエキサイティングな新しいモデルですが、確立するのは困難です。
ここで提供する包括的なプロトコルは、乳房オルガノイドの開発を試みる研究者の準備と、予想される課題を理解するのに役立つはずです。異なる患者に由来するすべてのPDO系統は、形態および成長率において独特である。2つの2D細胞株システムとは異なり、オルガノイドは高密度で播種するとよりよく成長し、より良い細胞間相互作用を可能にします。
手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるディシャ・アガルワルです。まず、地下膜マトリックスのボトルを氷上または摂氏4度で一晩解凍します。切除した組織を10センチメートルの滅菌ペトリ皿に移します。
組織を肉眼的に調べ、形態学的に脂肪、血管新生、または壊死しているように見えるかどうかをメモします。さらに、組織のサイズと形状を記録し、定規を視野に入れて組織の写真を撮ります。滅菌番号10メスで組織を細かく刻み、50ミリリットルの円錐管に移します。
1ミリリットルのコラゲナーゼIV溶液に10ミリリットルの2ミリグラムを加え、チューブを密封する。チューブを摂氏37度、140 RPMのオービタルシェーカーに30度の角度で30〜90分間置きます。インキュベーション中、ビーズまたは水浴中に摂氏37度で予熱する完全な培地のアリコートを置きます。
15分ごとに、5ミリリットルの滅菌済みプレコーティングされた血清学的ピペットを使用して激しく上下に混合することにより、組織を再懸濁します。チューブを顕微鏡下で5倍以上の倍率で観察することにより経時的に解離をモニターした。組織が解離したら、400 Gで5分間遠心分離し、上清を吸引し、10ミリリットルのAdDF +を再度加え、組織ペレットが緩むことがあるので、遠心分離して上清を注意深く吸引します。
組織ペレットが部分的に赤い場合は、2ミリリットルの赤血球溶解バッファーを加え、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、10ミリリットルのAdDF+をチューブに加え、400Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットを50〜300マイクロリットルの希釈されていない冷たい基底膜マトリックスに再懸濁し、気泡が形成されないように慎重にピペッティングして混合します。
インキュベーター内で一晩予め加温された6ウェル組織培養プレートを用いて、各ウェルにオルガノイドを含む300マイクロリットルの基底膜マトリックスドームのプレート。プレートをフード内で5分間乱さずに放置してから、基底膜マトリックスドームが完全に固まるまで摂氏37度で20〜30分間置きます。インキュベーションの終わりに、3ミリリットルの予め温めた完全培地を各ウェルに滴下し、摂氏37度および5%二酸化炭素でインキュベートする。
インキュベーション後、倒立明視野顕微鏡で5倍対物レンズを使用してオルガノイドの画像をキャプチャします。セルスクレーパーまたは1ミリリットルのピペットチップを使用して、基底膜マトリックスドームをウェル内の培地に持ち上げます。プレコートピペットチップを使用して、培地を含むオルガノイドのフローティングドームを、採取するウェルの数に応じて15または50ミリリットルのコニカルチューブに移します。
次に、DPBSを追加して、容量を少なくとも5ミリリットルに増やします。チューブを400 Gで5分間回転させます。オルガノイドを含む基底膜マトリックスは底部に層を形成します。
上清を吸引した後、チューブにプールされたウェルの数に応じて、5〜20ミリリットルのDPBSを追加します。オルガノイド基底膜マトリックスペレットを、プレコーティングされた滅菌使い捨てピペットを使用してDBPSで混合します。再度、遠心分離し、上清を廃棄する。
コーティングされたピペットチップを使用して、基底膜マトリックスの3倍の容量で細胞解離試薬を添加し、オルガノイドを再懸濁します。チューブを摂氏37度、140 RPMのオービタルシェーカーに角度を付けて8〜15分間置きます。チューブを5分ごとに顕微鏡で観察して監視し、オルガノイドがより小さなクラスターに分割されていることを確認します。
細胞解離試薬とピペット以上の容量でAdDF+を添加し、オルガノイドを混合します。400Gで5分間回転させ、オルガノイドペレットを得た。未溶解の基底膜マトリックスを含まない白色オルガノイドペレットが得られたら、上清を廃棄し、ペレットを1ミリリットルのAdDF+に再懸濁し、洗浄ステップのためにチューブを回転させて10ミリリットルに体積を作り、上清を廃棄します。
適切な分割比に基づいて、消化されたオルガノイドに必要量の基底膜マトリックスを追加します。泡が作らないようにゆっくりと上下にピペッティングして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。オルガノイドの300マイクロリットルのドームを、予め温めた6ウェルプレートの基底膜マトリックスに再懸濁したプレート。
プレートをフードに5分間乱さずに放置してから、ドームが固まるまで37%二酸化炭素で摂氏5度で20〜30分間置きます。インキュベーションの終わりに、3ミリリットルの予め温めた完全培地を各ウェルに、プレートをインキュベーターに戻す。5〜7日ごとに新鮮な完全培地を追加します。
様々な患者由来の乳房腫瘍オルガノイド株は、形態および増殖速度において異なる。正常な乳房オルガノイドとC2由来のオルガノイドの少数の初期乳管癌は、正常な乳房構造に似ており、中央の内腔が乳管細胞で囲まれていました。浸潤性小葉癌に由来するオルガノイドは、緩く付着したブドウの房のような構造を形成する傾向があります。
一方、浸潤性乳管癌由来のオルガノイドは、高密度で大きく丸いオルガノイドを形成する傾向があります。オルガノイドの成長は、3、6、9、および12日目に発光細胞生存率アッセイを使用して測定され、プレーティング後1日目にベースライン測定値が測定されました。時間経過に伴って拡大した同じオルガノイドの明視野画像を以下に示します。
患者由来のオルガノイド株の中には、倍加時間が2日になるものもあれば、5日かかるものもあります。確立が遅い特定のオルガノイドラインに我慢することが重要です。私たちの経験では、めっき密度を高めたり、破片をろ過したりすることで、PDOの成長が促進されます。
患者由来のオルガノイド(PDO)は、薬物スクリーニングの優れたモデルです。彼らは、がんの病態生理学を研究する上で鍵となる細胞間および細胞間マトリックス相互作用をモデル化しています。さらに、PDOは遺伝子操作を受けることができ、共培養システムで異種移植片を開発するために使用できるため、機構研究の優れたモデルになります。
