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1。マトリックスリガンドでコーティング表面<ol><li>超音波は、個々の皿として、または6ウェルプレートのいずれかとし、3.5 cmのウェルに細胞に適用されます。生化学的アッセイ、直接プラスチックの上にコートリガンド。免疫蛍光法では、沸騰ガラスは各ウェルの底に3つのMilliQ水で時間と場所4カバースリップをカバースリップ。 </li><li>ガラス表面は、効率的な配位子のコーティングを確保するために誘導体化しなければなりません。 1 mMのPBSでのスルホ-m-マレイミドベンゾイル-N-hydrosuccinimideエステルを溶解する。各ウェルに2ミリリットルを追加し、室温で30分間インキュベートします。 </li><li> PBSで誘導体化表面を3回洗浄します。 </li><li>コー​​トのいずれかの誘導体化ガラスやインテグリンリガンドと未処理のプラスチック。各ウェルに+とMg 2 +のCa 2を含むPBSに溶解し、10 ug / mlのインテグリンligand9 2mlを、適 ​​用し、4℃で一晩インキュベート℃、 </li><li> °C 13分間85にPBSに溶解し、1％BSAを、加熱することにより、BSAをmonoparticulate準備します。許可する冷却し、0.45μmフィルターを通過します。 </li><li> 30分間monoparticulate BSAを含むPBSとブロックとリガンド被覆表面を3回洗浄します。 </li></ol> 2。細胞の調製<ol><li>実験を通して行列環境を制御するには、タンパク質合成を2時間で80％コンフルエントに線維芽細胞から25μg/ mlのシクロヘキシミドの添加によりブロックされる必要があります。 </li><li> PBSでシクロヘキシミド処理した細胞をリンスし、0.5 mg / mlのトリプシン/ EDTAを用いて培養フラスコから取り外します。 </li><li> 5分間、500分の1 gで遠心分離により収穫剥離した細胞。 </li><li> DMEM/25 mMのHEPES、25μg/ mlのシクロヘキシミドで細胞を再懸濁します。 </li><li> haemocytometerを使用して、懸濁液の細胞密度をカウントし、105ミリリットル-1に希釈します。 </li><li>表面のインテグリンを回復するために20分間37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> PBSでリガンドでコーティングされた、BSA-ブロックのウェルを3回すすいでください。 </li><li>各ウェルに細胞懸濁液のシード2ミリリットル。 </li><li>アロ37℃で2時間分散させるワット細胞℃、5％CO 2。 </li></ol> 3。超音波刺激<ol><li> 37℃に超音波エミッタアレイとカップリングゲルを温める</li><li>各エミッタにゲルをカップリングの豆粒大のブロブを適用します。 </li><li>各エミッタは超音波インジケータダイオード検出器を用いて機能していることをテストします。 </li><li>エミッタアレイ上のウェルに配置します。 °C、5％CO 2、37の配列を返すと、温度が10分間平衡化することができます。 </li><li>超音波信号に切り替えます。 </li><li>超音波信号は、治療計画を模倣し、20分後に無効になります。短い刺激時間が必要な場合は、プレートを適切なポイント時に配列から削除する必要があります。すべてのケースで負の対照として刺激を受けていないプレートを使用しています。 </li></ol> 4。免疫蛍光法により接着斑の解析<ol><li>接着斑の形成の分析のために、20分間の超音波信号を適用するそして構造は37℃、5％CO 2で細胞を維持することによって、さらに40分のために開発することができます。 </li><li>培地を吸引除去し、PBSで2ミリリットルを4％パラホルムアルデヒドを適用することによって細胞を固定します。室温で14分間インキュベートします。 </li><li>パラホルムアルデヒドを吸引除去し、剪断力の発生を避けるために、井戸の縁の下静かにPBSを適用し、PBSで3回すすいでください。 </li><li> 3.5センチメートルからも、その後の免疫蛍光染色のために24ウェルプレートに各カバースリップを転送します。 </li><li> 24ウェルのそれぞれにPBSに0.5 mlの0.1 Mグリシンを適用することにより、残留ホルムアルデヒドを消す。室温で20分間インキュベートします。 </li><li>グリシンを吸引除去し、PBSで3回すすいでください。 </li><li>トリトンX-100 PBSで（w / v）の0.5パーセント0.5ミリリットルを適用することにより、細胞をPermeabilise。室温で4分間インキュベートします。 </li><li>トリトンX-100を吸引除去し、PBSで3回すすいでください。 </li><li> PBSに0.5ミリリットル3％（w / v）のBSAを適用することにより、ブロックします。 4＆Dで一晩インキュベートする。例えば、C. </li><li> BSAブロックで1:400に希釈しHVIN-1抗体とビンキュリン含有接着斑を染色する。室温で1時間インキュベートする。 </li><li> PBSで3回すすいでください。 </li><li>フルオロフォア（DyLight 488）標識二次抗体（1:200希釈）とBSAブロック内のTRITC標識ファロイジン（1:200希釈）で染色アクチンを適用します。室温で30分間インキュベートします。 </li><li> PBSで、一度水で3回すすいでください。 </li><li>ゴールド封入を延長使用して、反転位置でスライドガラス上にマウントします。 </li></ol> 5。プルダウンアッセイによるRac1の活性化の定量化<ol><li> Rac1の活性化の分析のために、37細胞に20分間の超音波信号を適用します°C、5％CO 2。 20分以上応答時間を評価する際に、20分間超音波信号を適用し、応答が開発できるように残り時間を37°C、5％CO 2で細胞を維持します。 </li><li>よくメディアや場所を吸引氷の上だ。 2ミリリットルの冷PBSと吸引でウェルを洗浄します。残ったPBSを徹底的に吸引に続いて1分間に傾い井戸を残していないことを確認します。 </li><li>ウェルあたり35μlの溶解バッファー（10％グリセロール、20mMのHEPES pH7.4で、140mMのNaCl、1％NP40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、4 mMのEGTA、4mMのEDTA、1×コンプリートプロテアーゼ阻害剤）と氷上で細胞を溶解します。この例では、6ウェルの細胞ライセート210μlを生成するために時点ごとに使用されています。より多くのまたはより少ない井戸が使用できますが、ライセート中の総体積は約200μlを合計する必要があります。 </li><li>完全な細胞溶解を確保し、プールにライセートを可能にするために1分間傾け井戸を残すためにセルスクレーパーで細胞を十分に落とす。 </li><li>ペレット、細胞残渣に4°Cで2分間21000氷冷1.5 mlのマイクロ遠心チューブ（同じ治療体制からプーリング溶解）とスピン×gにライセートを移します。 </li><li>溶解バッファー130μlと25μlのPAK-GLUTを含む1.5 mlのマイクロチューブは氷冷にライセート180μlを転送athioneアガロースビーズ10。その後のゲル分離のための-20°Cで、残りの粗溶解物を保持します。 </li><li> 4℃で40分間チューブを回転させることによってPAK-グルタチオンアガロースビーズ上のアクティブなRac1のキャプチャ℃に</li><li>収穫アガロースビーズは、2000年の遠心分離によりコンジュゲート×gで1分間、4℃ </li><li>洗浄ビーズは、各洗浄後、2000X gと廃棄上清を遠心分離によりビーズを収穫、500μlの溶解緩衝液で3回コンジュゲート。慎重に200μlのピペットを用いて残りの溶解洗浄バッファーを削除します。 </li><li> 5分間振とうヒートブロックで85℃35μlのSDS-PAGEローディングバッファーとインキュベート°Cを追加することにより、各サンプルを溶出します。 1分間21000×gで遠心分離によりビーズを除去します。 </li><li> SDS-PAGEによりビーズ溶出液を解決し、Rac1のためのニトロセルロースとプローブに転送します。 </li></ol> 6。代表的な結果このプロトコルでは、ビンキュリン、汚れの誘導を説明するED焦点癒着と超音波によるRac1の活動。焦点接着実験では、ベースラインの位置がα5β1インテグリンのリガンドに広がる線維芽細胞は第二フィブロネクチン受容体、シンデカン-4、限りビンキュリン含有癒着（ 図3A）を形成しないことですが添加することにより行っています可溶性リガンド（ 図3B）3,4。しかし、超音波による刺激は、超音波刺激はフィブロネクチン依存シグナル伝達経路5の特定のコンポーネントに置き換えることができたことを示す、シンデカン-4（ 図3C）との係合と同程度に接着斑の形成を誘導する。このプロトコルのキーのハードルは覚せい剤の非存在下での接着斑の形成を排除されています。シクロヘキシミドによるタンパク質合成の不完全な阻害は、auto-刺激に対する細胞のために十分であるマトリックスの沈着をできるようになります。セルの過密は、低レベルの接着斑構成体につながることができますnおよび細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス間の接点間のクロストークなどの超音波に反応不良は、単一の刺激を分離するために設計された実験が複雑になります。基本的なアッセイの開発として、我々はシンデカン-4（ 図4）欠けている線維芽細胞を繰り返し同じ実験を、示しています。これらの線維芽細胞は、まだ超音波（ 図4C）に対応するが、シンデカン- 4リガンド（ 図4B）に応答しなかった。 Sdc4を用いた実験- / -繊維芽細胞では、超音波は確かに特定のフィブロネクチン受容体の必要性をバイパスすることができますを示し、単純なプロトコルは、シグナル伝達経路に関する追加情報を得るために開発する方法を示しています。 生化学的な実験のために我々は、超音波は、デル·ポソら 10記載の方法を適応したものです。プルダウンアッセイを用いて、Rac1の活性化を誘導することができますを示しています。アクティブRac1の0、10、30とini 60分後の降水量超音波刺激のtiationは、ベースライン（ 図5）に戻る前に、10〜30分でそのRac1の活性ピークを明らかにする。ビンキュリンの粗ライセートをウェスタンブロッティングには時間がポイントの間に相当の負荷を確実にします。その結果、シンデカン- 4 3の係合によりRac1の活性化に似ていますが、フィブロネクチンによる活性化よりも若干長引くです。したがって、8月10日リピートは、通常、重要なデータを達成するために必要とされています。 Rac1の活性化は、接着斑の形成への細胞のコミットメントの責任であり、初期の接着斑は、Rac1の活性化と一致、10〜30分で形成し始める。一度開始され、これらの癒着は、 図3と図4に示すように、大規模な接着斑に成熟していきます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> 図1超音波形。超音波は断続的に1.5 MHzの信号を含む、低振幅（30 MW / CM &lt;のために&gt; 2、空間平均、時間平均のsup）は加熱効果がありません。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> 図2超音波による細胞の調製と刺激のためのワークフローの模式図。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> 図3。線維芽細胞の接着斑形成の超音波誘導。線維芽細胞は、フィブロネクチン（B）や超音波（C）のシンデカン-4 - 結合フラグメントで刺激する前に、フィブロネクチンのインテグリン結合フラグメント（）上に広げた。 60分の刺激後、細胞を固定したビンキュリンとアクチンを染色し、落​​射蛍光とにより撮​​像された。バー=10μmである。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> 図4。シンデカン-4を欠損線維芽細胞の接着斑形成の超音波誘導。 <em&gt; Sdc4 - / -繊維芽細胞はシンデカン-4結合フィブロネクチンのフラグメント（B）や超音波（C）による刺激の前にフィブロネクチンのインテグリン結合フラグメント（）上に広げた。 60分の刺激後、細胞を固定したビンキュリンとアクチンを染色し、落​​射蛍光とにより撮​​像された。 - / - Sdc4が線維芽細胞はフィブロネクチンと小文字を区別した、超音波はまだその超音波は、マトリックス受容体の関与をバイパスすることを示す、接着斑の形成を誘導した。バー=10μmである。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> 図5超音波によるRac1の活性化。細胞は、0、10、30、時点ごとに使用される6ウェルで60分間刺激した。量GTP-Rac1のRac1のプルダウンアッセイ時間コースからのサンプル中に存在するウェスタンブロット（上画像）に抗Rac1の抗体とインキュベートすることにより可視化した。バンド強度の定量化（8-10の平均は複製）Rac1の増加を明らかにctivityは60分（グラフ）でベースラインのレベルに戻る前に、10〜30分の超音波信号から得られる。エラーバーはSEMを表す

<ol>
	<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis.">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li><li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4.">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix.">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li><li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments.">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li><li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1.">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li><li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound.">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li><li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive,+low-intensity+pulsed+ultrasound.">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li><li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific,+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter,+prospective,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li><li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1.">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li><li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK.">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li><li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII/IIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1.">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li></ol>

アンドリュー·ハリソンは、スミス·アンド·ネフュー英国限定の従業員です。

このプロトコルでは、我々は通常、人間の患者に適用される治療は、細胞ベースの実験で使用することができる方法について説明します。究極の目標は、治療が洗練されたことができるように超音波作用の分子機構を理解することです。このプロトコルでは、モデル細胞系としてマウス胚繊維芽細胞（MEF）を使用していますが、超音波は、初代ヒト包皮線維芽細胞5、間葉系幹細胞、骨芽細胞および軟骨細胞6で有効であることが判明してされています。ここでは、例の生化学的アッセイとしてRac1の活性化を使用していますが、方法は同様にタンパク質のリン酸化や免疫沈降によるタンパク質複合体の形成の調節をテストするために使用することができます。免疫例では、接着斑形成に効果の超音波を発揮しますが、分子の再配分を検討することができます。たとえば、一つはproteのcolocalisation、形質膜への細胞質因子の補充をテストすることができます人身売買の小胞のプラグインまたは有糸分裂紡錘体の組織に超音波の効果を調べる。これまでのところ我々は、自身がコラーゲンで、または成長因子の存在下で超音波は、複雑な環境下で細胞の挙動にどのような影響を与えるかの画像を構築するためにテストすることができ、細胞に超音波の効果により、フィブロネクチン - 依存性経路をテストするために閉じ込められたことをより多くの密接にin vivoでの状況は似ています。大きな課題は、エミッタの存在は超音波検査現在、追加の技術的な障害からの光パスや振動を遮断するタイムラプスイメージングを使用して、超音波の効果をテストすることになります。しかし、治療への応用は、日あたりの刺激のわずか20分を必要とするという事実は、刺激のバースト後の細胞の挙動の分析がよく生産性を得ることを示唆している。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>スルホ-m-マレイミドベンゾイル-N-hydrosuccinimideエステル</td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td>水に溶解し、25mMの株式は-20℃で保存することができます</td></tr><tr><td> 6ウェル組織培養プレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3516 </td><td>他の企業からプラスチックが不完全にコートすることができ</td></tr><tr><td> 13 mmのカバーガラス</td><td>科学的な実験室用品Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td>他の会社からのガラスは不完全にコートすることができ</td></tr><tr><td> PBS </td><td>シグマ</td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBSは、Ca 2 +はMg 2 + </td><td>シグマ</td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50Kインテグリンリガンド（フィブロネクチンフラグメント） </td><td>説明と事前に構築する9、11にparation </td><td></td><td>別のマトリックスリガンドは他の経路を調べるために使用できます</td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマ</td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>シグマ</td><td> C7698 </td><td>水に10mg/mlストックとして保存することができます</td></tr><tr><td> DMEM/25 mMのHEPES </td><td>シグマ</td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td>外生植物4000 + </td><td>スミス·アンド·ネフュー株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波カップリングゲル</td><td>スミス·アンド·ネフュー株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHSインジケータ</td><td>スミス·アンド·ネフュー株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> HVIN-1 </td><td>シグマ</td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488標識抗マウス</td><td> Stratech科学</td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC標識ファロイジン&lt;/ TD&gt; <td>シグマ</td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Gold褪色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td>コンプリートプロテアーゼ阻害剤（EDTAフリー） </td><td>ロシュ社</td><td> 056 489 001 </td><td> 100×-20℃で保存タブレットから成って株式</td></tr><tr><td> PAK-グルタチオンアガロースビーズ</td><td> 10の説明と準備を構築する</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>アポロ科学</td><td> BI8181 </td><td> 7.4に1M株式やpHを行う</td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フィッシャー</td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td>シグマ</td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマ</td><td> E4378 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound

多細胞生物において、細胞の挙動は細胞外マトリックスとの相互作用によって決定されます。細胞の遊走と増殖の調節から、分泌、さらに分化に行列係範囲の結果。これらの複雑なプロセスのそれぞれの基礎となる信号は、細胞の表面上の細胞外マトリックス受容体の分子間相互作用から生じる。インテグリンは原型の受容体であると機械的な細胞外マトリックスと細胞骨格の間のリンクと同様に、接着依存性のシグナル伝達カスケードのいくつかを開始することを提供しています。しかし、それは追加の膜貫通受容体がインテグリン下流そのものと信号の両方を調節するインテグリンと一緒に機能していることをますます明らかになっています。これらの例の中で最もエレガントなフィブロネクチンへの接着時のα5β1インテグリンと協力して貫通プロテオグリカン、シンデカン- 4である。in vivoモデルdemonstr でシンデカン-4ノックアウトマウスは非効率的な線維芽細胞への移行1,2による治癒遅延を示すように、シンデカン- 4シグナリングの重要性を食べました。野生型動物では、傷に向かって線維芽細胞の移行は、破損した毛細血管からリークとは、負傷した組織内のマクロファージによって堆積されているフィブロネクチンの出現によってトリガされます。したがって、フィブロネクチン - 依存性のシグナル伝達を強化し、修復プロセスを加速させることができる戦略を発見することに大きな関心があります。 インテグリン媒介およびフィブロネクチン - 依存性のシグナル伝達のシンデカン-4を介したコンポーネントの組換えフィブロネクチンフラグメントによる刺激細胞で分離することができます。インテグリンの関与は、細胞接着に必須であるが、特定のフィブロネクチン - 依存性の信号は、シンデカン - 4で規定されている。シンデカン-4活性化Rac1の突出信号3は 、焦点にインテグリン配布1、などビンキュリンなど細胞骨格分子のトリガ募集を引き起こし、癒着4、それによって方向性のある移動3を誘導する 。我々はこのようなシグナルを活性化するための代替戦略を見て、低強度パルス超音波（LIPUS）がシンデカン- 4婚約5の効果を模倣できることを見出した。このプロトコルでは、我々は、1 kHz（ 図1）でパルスで30 MW / cm 2と 、1.5 MHzの超音波検査方法は、Rac1の活性化と接着斑の形成を誘導する培養中の線維芽細胞（ 図2）に適用することができますについて説明します。このパラメーターの組み合わせは、臨床骨折修復6の加速のための最も効果的であることが判明しているように超音波刺激は、20分の最大値に適用される。メソッドは、シンデカン-4の関与なしにα5β1インテグリンを、従事する組換えフィブロネクチンフラグメントを使用しており、線維芽細胞による追加的な行列の沈着を阻止するシクロヘキシミドによるタンパク質合成の阻害を必要とします。、正の効果O修復機構のF超音波はよく7,8に記載されていると、文化の中で超音波の分子の影響を理解することによって我々は臨床転帰を改善する治療技術を改良することができるはずです。

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Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

このプロトコルは、接着斑の形成と膜貫通マトリックス受容体、シンデカン-4の関与を模倣することによってRac1の活性化を駆動する低強度パルス超音波による培養線維芽細胞の刺激を説明しています。このアプローチは、それによって治療法の改良の機会を提供する、細胞レベルで成功した臨床技術の調査を可能にします。

低強度の超音波を用いた接着依存性のシグナルの誘導

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K ビュー.  University of Bristol. このプロトコルは、接着斑の形成と膜貫通マトリックス受容体、シンデカン-4の関与を模倣することによってRac1の活性化を駆動する低強度パルス超音波による培養線維芽細胞の刺激を説明しています。このアプローチは、それによって治療法の改良の機会を提供する、細胞レベルで成功した臨床技術の調査を可能にします。

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Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

コントラストの超音波は、薬剤ベアリングナノ粒子デリバリーと微小血管アブレーションを経由してマウスの神経膠腫の治療を対象と

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

生物工学

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

超音波標的マイクロバブル破壊テクニック入門

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

医療画像処理アプリケーションのための超音波の広帯域光検出器

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

高強度のリアルタイムモニタリングの超音波（HIFU）アブレーションを重視しました<em&gt;インビトロ</em集束超音波のための調和運動イメージングの使用&gt;犬の肝臓（HMIFU）

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the light distortion during the propagation within the fiber. Our methodology is based on digital optical phase conjugation employing only a single spatial light modulator, where the optical wavefront is individually modulated at different regions of the modulator, one region per light signal. Digital optical phase conjugation approaches are considered to be faster than other wavefront shaping approaches, where (for example) a complete determination of the wave propagation behavior of the fiber is performed. In contrast, the presented approach is time-efficient since it only requires one calibration per light signal. The proposed method is potentially appropriate for spatial division multiplexing in communications engineering. Further application fields are endoscopic light delivery in biophotonics, especially in optogenetics, where single cells in biological tissue have to be selectively illuminated with high spatial and temporal resolution.

We demonstrate the transmission of multiple independent signals through a multimode fiber using wavefront shaping employing a single spatial light modulator. By modulating the wavefront for each signal individually, spatially separated foci are transmitted. Potential applications are multiplexed data transfer in communications engineering and endoscopic light delivery in biophotonics.

ウェーブフロントシェイピングを用いた光ファイバを介して複数の信号の伝送

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

腹部大動脈組織模倣ヒドロゲル製造超音波エラストグラフィ検証用ファントム

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

脳血流をモニタリングするための機能性経頭蓋ドップラー超音波

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation (SHAPE) Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound imaging are gas-filled, encapsulated microbubbles (diameter &#60; 10 &#956;m) that traverse the entire vasculature and enhance signals by up to 30 dB. These microbubbles also produce nonlinear oscillations at frequencies ranging from the subharmonic (half of the transmit frequency) to higher harmonics. The subharmonic amplitude has an inverse linear relationship with the ambient hydrostatic pressure. Here an ultrasound system capable of performing real-time, subharmonic aided pressure estimation (SHAPE) is presented. During ultrasound contrast agent infusion, an algorithm for optimizing acoustic outputs is activated. Following this calibration, subharmonic microbubble signals (i.e., SHAPE) have the highest sensitivity to pressure changes and can be used to noninvasively quantify pressure. The utility of the SHAPE procedure for identifying portal hypertension in the liver is the emphasis here, but the technique has applicability across many clinical scenarios.

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation SHAPE Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

A protocol for noninvasively estimating ambient pressures utilizing subharmonic ultrasound imaging of infused contrast microbubbles (following appropriate calibration) is described with examples from human patients with chronic liver disease.

門脈圧亢進症の同定に着目した超音波画像を用いた造影補助圧力推定(SHAPE)

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic toxicity and increases circulation time of the drugs. In a novel approach to microbubble-assisted drug delivery, nanoparticles are incorporated in or on microbubble shells, enabling local and triggered release of the nanoparticle payload with ultrasound. A thorough understanding of the release mechanisms within the vast ultrasound parameter space is crucial for efficient and controlled release. This set of presented protocols is applicable to microbubbles with a shell containing a fluorescent label. Here, the focus is on microbubbles loaded with poly(2-ethyl-butyl cyanoacrylate) polymeric nanoparticles, doped with a modified Nile Red dye. The particles are fixed within a denatured casein shell. The microbubbles are produced by vigorous stirring, forming a dispersion of perfluoropropane gas in the liquid phase containing casein and nanoparticles, after which the microbubble shell self-assembles. A variety of microscopy techniques are needed to characterize the nanoparticle-stabilized microbubbles at all relevant timescales of the nanoparticle release process. Fluorescence of the nanoparticles enables confocal imaging of single microbubbles, revealing the particle distribution within the shell. In vitro ultra-high-speed imaging using bright-field microscopy at 10 million frames per second provides insight into the bubble dynamics in response to ultrasound insonation. Finally, nanoparticle release from the bubble shell is best visualized by means of fluorescence microscopy, performed at 500,000 frames per second. To characterize drug delivery in vivo, the triggered release of nanoparticles within the vasculature and their extravasation beyond the endothelial layer is studied using intravital microscopy in tumors implanted in dorsal skinfold window chambers, over a timescale of several minutes. The combination of these complementary characterization techniques provides unique insight into the behavior of microbubbles and their payload release at a range of time and length scales, both in vitro and in vivo.

The presented protocols can be used to characterize the response of fluorescently-labeled microbubbles designed for ultrasound-triggered drug delivery applications, including their activation mechanisms as well as their bioeffects. This paper covers a range of in vitro and in vivo microscopy techniques performed to capture the relevant length and timescales.

超音波誘発薬物放出のための蛍光標識マイクロバブルの特性評価のためのマルチタイムスケール顕微鏡法

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

インビトロ 膵臓系統に向けたヒト歯髄幹細胞の誘導

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...