本研究は、日本学術振興会科学研究費助成事業(科研費)の支援を受けて行われました。JP19K10259と 22K10032 を MAI に変更)。

このプロトコルでは、4週齢の雄のヌードマウスを使用します。4匹のマウスをケージに入れ、22〜24°C、相対湿度50%〜70%で12時間の明暗サイクルで飼育します。動物実験は、東京医科歯科大学動物実験委員会が承認したガイドライン(承認ID:A2019-204C、A2020-116A、A2021-121A)に準じて実施しました。
1. 緩衝液および試薬の調製
<ol><li>間葉系幹細胞増殖培地(MSC増殖培地)をMSC基礎培地にMSC増殖培地のサプリメントキットを添加し、4°Cで保存します。</li>
	<li>10%ウシ胎児血清(FBS)、50 μg/mLゲンタマイシン、200 μM L-アラニル-L-グルタミン、および1 ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子を培地に添加して、ダルベッコ改変イーグル培地およびハムF12(DMEM/F-12)培地を調製し、4°Cで保存します。</li>
	<li>使用直前に、1% ITS-Gサプリメント、0.12%ウシ血清アルブミン、50 μg/mLゲンタマイシン、0.35 mM L-プロリン、100 nMデキサメタゾン、および10 ng/mL TGF-β3をDMEMに添加して、軟骨形成培地を調製します。</li>
	<li>使用直前に、10 mM β-グリセロリン酸、0.12% ウシ血清アルブミン、10 nM デキサメタゾン、200 μM アスコルビン酸-2-リン酸、50 nM L-チロキシン、50 μg/mL ゲンタマイシン、50 pg/mL IL-1β を DMEM に添加して、肥大培地を調製します。</li>
	<li>60°Cに予熱した200μLの溶融パラフィンを24ウェル培養皿にコーティングします。 パラフィンが固まるまで室温で放置します。</li>
</ol>2. ヒト間葉系幹細胞の拡大
注:実験を開始する前に、MSC軟骨形成の可能性が高いMSCをマイクロマス培養で選択する必要があります。
<ol><li>製造業者の指示に従い、初代ヒト骨髄由来MSC(継代2)を、5%CO2および95%加湿空気インキュベーター中で、5×103細胞/cm2の密度で10cmのディッシュにMSC増殖培地で培養する。</li>
	<li>培地は2〜3日ごとに交換してください。細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、真空ポンプを使用して細胞培養皿から培地を吸引し、5 mLのPBSで洗浄した後、真空ポンプで溶液を吸引します。</li>
	<li>1 mLの0.05%トリプシン/0.02%EDTA溶液を皿に加えます。ディッシュを37°Cで5〜10分間インキュベートします。</li>
	<li>MSC増殖培地1 mLを添加して、酵素反応を停止します。細胞懸濁液を50 mLチューブに移します。</li>
	<li>他のディッシュからの細胞懸濁液を50 mLチューブに入れ、氷上に保管します。</li>
	<li>セルカウンターを使用して、10 μLの細胞懸濁液と10 μLの0.4%トリパンブルー染色剤を混合して細胞をカウントします。</li>
	<li>残りの細胞懸濁液を220 x g で室温で3分間遠心分離します。上清を除去し、1.0 x 106 細胞/mLの濃度で凍結保存液を添加する。</li>
	<li>細胞懸濁液1 mLを各クライオチューブに分注し、-80°Cで12時間保存してから液体窒素に移します。得られた凍結ストック(継代3)は、このプロトコルに使用されます。</li>
	<li>実験では、ストックしたMSCを10cmの皿に5 x 103 細胞/cm2の密度で播種します。DMEM/F-12培地中で80%〜90%のコンフルエント(継代4)まで細胞を培養します。</li>
</ol>3. MSC内包ハイドロゲルの調製
<ol><li>細胞をトリプシン化し、ステップ2.3〜2.6の説明に従って細胞懸濁液を調製します。</li>
	<li>10個のコンストラクト(コンストラクトあたり2.5 x 10 5細胞)を作製するには、2.5 x 106個の細胞を含む細胞懸濁液を1.5 mLのマイクロチューブに分注します。</li>
	<li>懸濁液を220 x g で3分間遠心分離し、真空ポンプで上清を除去し、氷上に保持します。</li>
	<li>チオール変性ヒアルロン酸(HA)、チオール反応性架橋剤、ポリエチレングリコールジアクリレート、脱気したウォーターボトルを室温に戻します。</li>
	<li>無菌条件下で、針付きのシリンジを使用して、1.0 mLの脱気水をHA含有ボトル(製造元の指示を参照)に加えます。</li>
	<li>溶液が透明になるまで時々37°Cに温め、氷の上に置きます。固形物が完全に溶解するのに30分もかかりません。</li>
	<li>無菌条件下で、針付きのシリンジを使用して、0.5 mLの脱気水を架橋剤ボトルに加えます。数回ひっくり返して溶かし、氷の上に置きます。</li>
	<li>溶解したHA溶液120 μLを分注した細胞ペレット(2.5 x 106 細胞)に加えます。細胞ペレットをピペッティングで前後に再懸濁します。</li>
	<li>溶解した架橋剤溶液30 μLをHAと細胞の入ったチューブに加え(ステップ3.8)、チューブを軽くたたいて混ぜ合わせ、短時間スピンダウンします。HA溶液と架橋剤溶液を4:1の比率で組み合わせます。</li>
	<li>MSCを含む混合溶液15 μL(2.5 x 105 細胞)をパラフィンコーティングした24ウェルプレートに滴下し、37°Cで30分間固化させます(図2)。粘度が高いため、細胞/ハイドロゲル混合物を必要量より少なくとも10%多く調製してください。 注:ヒドロゲルの特性は、以前に説明した39。</li>
</ol>4. in vitro での分化条件
<ol><li>0.5 mLの軟骨形成分化培地をMSC播種HAハイドロゲルのコンストラクトに添加します。培地は2〜3日ごとに交換してください。</li>
	<li>3週間後、肥大分化培地(ウェルあたり0.5 mL)に切り替え、コンストラクトをさらに2週間培養します。</li>
</ol>5. 間葉系幹細胞の 生体内 移植
<ol><li>合計5週間のin vitro培養の後、前述のように、構築物をヌードマウスの背中に皮下移植します38,40。</li>
	<li>マウスの体重を量り、0.75 mg / kg体重(b.w)のメデトミジン、4.0 mg / kgのb.w.ミダゾラム、および5.0 mg / kgのb.w.ブトルファノールで調製した併用麻酔薬を腹腔内注射で投与します38。</li>
	<li>手術刺激に対して動かないことで適切な麻酔を確認し、ゆっくりとした規則的な胸の動きによる呼吸の深さを監視し、手術中に定期的にピンクの粘膜の色による適切な酸素供給を監視します。麻酔中の乾燥を防ぐために、目に獣医用軟膏を使用してください。</li>
	<li>マウスを滅菌手術用ドレープの上に腹臥位で置き、切開部位を50ppmの次亜塩素酸水(pH 5.0;HAW)、穴あき外科用ドレープをマウスの上に置きます。 注意: すべての手術材料をオートクレーブ、エチレンオキシドガス、またはHAWで滅菌します。外科医は指を洗い、手術用ガウンと手袋を着用する必要があります。</li>
	<li>背骨の中心線に沿って、肩と腰の部分に長さ5mmの皮膚切開を2cm間隔で2つ、ハサミで行います。</li>
	<li>切開部から皮下にヘラを挿入し、皮下ポケットを作ります。</li>
	<li>2〜3つのコンストラクト(各~15 μL、ステップ5.1)を鉗子で各ポケットに挿入します。同じポケットに埋め込まれたHAコンストラクトは、非常に頻繁に癒合する傾向があります。癒着を防ぐため、各ポケットに HA コンストラクトを 1 つずつ挿入します。</li>
	<li>4-0の編組シルク縫合糸で切開部を閉じます。38に記載されているように、0.75 mg / kg b.w.アチパメゾールで調製した麻酔薬にアンタゴニストをマウスに注射します。.</li>
	<li>マウスが麻酔から回復するまでの間、マウスを餌や水のボトルを使わずに滅菌床寝具を含む滅菌回復ケージに入れ、体温、脈拍、呼吸を継続的に監視します。</li>
	<li>マウスが胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。完全に回復したら、他の動物と一緒に飼育室に戻します。</li>
	<li>治癒期間中、数日ごとに動物を監視して、合併症の可能性がないか確認してください。二酸化炭素を吸入してマウスを安楽死させるが、着床後4週間および8週間でほとんど苦痛を伴わない。</li>
	<li>移植された部位の皮膚を切開し、鉗子で移植された構造物を取り除きます。コンストラクトを4%パラホルムアルデヒドで16時間固定し、分析します。</li>
</ol>6. 統計解析
<ol><li>定量的データを平均±標準偏差 (SD) としてレポートします。市販のソフトウェアを使用して統計分析を実行します。</li>
	<li>スチューデントの t検定または一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して、グループ間の有意差を判断します。p<0.05 と p<0.01 は、2 つのグループ間の有意差を示しています。</li>
</ol>

軟骨内骨化による骨再生のための人工軟骨インプラント

著者らは、競合する利害関係は存在しないと宣言しています。

肥厚軟骨から骨への移行を促進する適切な足場材料を使用することは、MSCベースの人工肥厚軟骨移植片をスケールアップし、臨床的に有意なサイズの骨欠損を治療するための有望なアプローチです。本研究では、HAがin vitroでMSCベースの肥大軟骨組織の分化をサポートし、in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた足場材料であることを示しています38。さらに、<em...

自家骨は、外傷、先天性欠損、外科的切除による骨欠損を修復するためのゴールドスタンダードです。しかし、自家骨移植には、ドナーの痛み、感染のリスク、患者から分離できる骨量の制限など、重大な制限があります1,2,3,4。天然または合成ポリマーとリン酸カルシウムやハイドロキシアパタイトなどの鉱化材料を組み合わせた骨代替物として、数多くの生体材料が開発されています5,6。これらの人工材料における骨形成は、通常、幹細胞が膜内骨化(IMO)プロセスを通じて骨芽細胞に直接分化することを可能にするプライミング材料として、石灰化材料を使用して達成される7。このプロセスは血管新生ステップを欠いており、移植後の移植片のin vivo血管新生が不十分であり8,9,10、したがって、そのようなプロセスを使用するアプローチは、大きな骨欠損の治療に最適ではない可能性があります11。
発生中の骨格形成における生来のメカニズムである軟骨内骨化(ECO)プロセスを再現するために適用された戦略は、従来のIMOベースのアプローチに関連する重大な問題を克服することが示されています。ECOでは、軟骨テンプレートの軟骨細胞が血管内皮増殖因子(VEGF)を放出し、血管浸潤と軟骨テンプレートの骨へのリモデリングを促進します12。軟骨リモデリングと血管新生による骨形成へのECOを介したアプローチは、骨折修復中にも活性化され、MSCに由来する人工的に作成された軟骨組織をプライミング材料として使用します。軟骨細胞は、骨欠損の低酸素症に耐え、血管新生を誘導し、血管のない軟骨移植片を血管新生組織に変換することができます。MSCベースの軟骨移植片は、そのようなECOプログラムを実施することにより、in vivoで骨を生成することが多くの研究で報告されています13、14、15、16、17、18、19、20、21。
このECOを介したアプローチの臨床応用に不可欠な要件は、臨床現場で必要な量の軟骨移植片を準備する方法です。実際の骨欠損にフィットするサイズの臨床軟骨を作製することは現実的ではありません。したがって、移植軟骨は、複数の断片が移植されるときに骨を一体的に形成する必要があります22。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップするための魅力的なツールとなる可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、in vitroでのMSC軟骨形成およびin vivoでのECO形成をサポートします23,24,25,26,27,28,29,30,31,32;しかし、臨床応用の要件を満たすための最適な支持材料は未定のままです。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスに存在する生分解性で生体適合性の多糖類である33。HAはCD44などの表面受容体を介してMSCと相互作用し、軟骨形成分化をサポートします25,26,28,30,31,32,34。さらに、HAスキャフォールドはIMOを介したヒト歯髄幹細胞の骨形成分化を促進し35、コラーゲンと組み合わせたスキャフォールドはECOを介した骨形成を促進する36,37。
ここでは、骨髄由来の成人ヒトMSCを用いたHAハイドロゲルの調製方法と、in vitroでの肥大型軟骨形成およびその後のin vivo軟骨内骨化への使用について紹介する38。我々は、HAの特性を、MSCを用いた骨組織工学に広く適用され、軟骨内骨化のための人工移植片のスケールアップに有用な材料であるコラーゲンの特性と比較した17。免疫不全マウスモデルにおいて、ヒトMSCを播種したHAおよびコラーゲンコンストラクトを皮下移植によりin vivo ECOの可能性について評価しました。その結果、HAハイドロゲルは、間葉系幹細胞がECOによる骨形成を可能にする人工軟骨移植片を作るための足場として優れていることが示されました。
プロトコルは2つのステップに分かれています。まず、ヒアルロン酸ハイドロゲル上に播種されたヒト間葉系幹細胞のコンストラクトを調製し、 in vitroで肥厚軟骨に分化させる。次に、分化した構築物をヌードモデルに皮下移植し、 in vivo で軟骨内骨化を誘導します(図1)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13571-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker</td>
			<td>GC Lymphotec</td>
			<td>CS-02-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic fibroblastic growth factor</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>RCHEOT002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>012-23881</td>
			<td>7.5 w/v%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Domitor</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dormicum</td>
			<td>Astellas Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6429</td>
			<td>high glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>1676045</td>
			<td>&#160;10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haccpper Generator</td>
			<td>TechnoMax</td>
			<td>CH-400-5QB</td>
			<td>50 ppm hypochlorous acid water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyStem Cell Culture Scaffold Kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HYS020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#223;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-G supplement</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>090-06741</td>
			<td>&#215;100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>016-21841</td>
			<td>200mmol/L (&#215;100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29001-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Thyroxine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 
			BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>165-13375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS / pH7.4 100ml</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-2051-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;3&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>HZ-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>Meiji Seika Kaisha</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiocare Ointment</td>
			<td>SAVAVET/SAVA Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>048-34332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated bone formation through in vivo endochondral ossification using mesenchymal stem cells

間葉系幹細胞(MSC)を用いた従来の骨再生療法は、血管新生を誘導するメカニズムがないため、臨界サイズ以上の骨欠損への適用が困難でした。間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植すると、軟骨内骨化(ECO)を介して in vivo で血管新生と骨形成が誘導されます。したがって、このECOを介したアプローチは、将来的に有望な骨再生療法になる可能性があります。このECOを介したアプローチの臨床応用の重要な側面は、骨欠損を修復するために移植するのに十分な軟骨を準備するためのプロトコルを確立することです。特に、実際の骨欠損の形状に適合するサイズの移植軟骨の単一の塊を設計することは現実的ではありません。そのため、移植する軟骨は、複数個を移植した際に一体的に骨を形成する性質を持っている必要があります。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップして臨床要件を満たすための魅力的なツールである可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、 in vitro でのMSC軟骨形成やin vivoでのECO形成をサポートしますが、臨床応用のニーズを満たす最適な足場材料はまだ決定されていません。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスの重要な成分であり、生分解性で生体適合性の多糖類です。本研究では、HAハイドロゲルが間葉系幹細胞ベースの軟骨組織の in vitro 分化をサポートし、 in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた特性を有することを示しました。

Autologous bone is still the gold standard for repairing bone defects due to trauma, congenital defects, and surgical resection. However, autogenous bone grafting has significant limitations, including donor pain, risk of infection, and limited bone volume that can be isolated from the patients1,2,3,4. Numerous biomaterials have been developed as bone substitutes, combining natural or synthetic polymers with mineralized materials such as calcium phosphate or hydroxyapatite5,6. Bone formation in these engineered materials is usually achieved using the mineralized material as a priming material to allow stem cells to differentiate directly into osteoblasts through the intramembrane ossification (IMO) process7. This process lacks the angiogenic step, resulting in insufficient in vivo vascularization of the graft after implantation8,9,10, and therefore, approaches using such a process may not be optimal for treating large bone defects11.
Strategies applied to recapitulate the endochondral ossification (ECO) process, an innate mechanism in skeletogenesis during development, have been shown to overcome significant problems associated with traditional IMO-based approaches. In ECO, chondrocytes in the cartilage template release vascular endothelial growth factor (VEGF), which promotes vascular infiltration and remodeling of the cartilage template into bone12. The ECO-mediated approach to osteogenesis via cartilage remodeling and angiogenesis, which is also activated during fracture repair, uses artificially created cartilage tissue derived from MSCs as a priming material. Chondrocytes can tolerate hypoxia in bone defects, induce angiogenesis, and convert a vascular-free cartilage graft into angiogenic tissue. Numerous studies have reported that MSC-based cartilage grafts generate bone in vivo by implementing such an ECO program13,14,15,16,17,18,19,20,21.
An essential requirement for the clinical application of this ECO-mediated approach is how to prepare the desired amount of cartilage graft in a clinical setting. Preparing clinical cartilage of a size that fits the actual bone defect is not practical. Therefore, graft cartilage must form bone integrally when multiple fragments are implanted22. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification. Many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; however, the optimal support material to meet the clinical application requirements has remained undetermined. Hyaluronic acid (HA) is a biodegradable and biocompatible polysaccharide present in the extracellular matrix of cartilage33. HA interacts with MSCs via surface receptors such as CD44 to support chondrogenic differentiation25,26,28,30,31,32,34. In addition, HA scaffolds promote IMO-mediated osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells35, and scaffolds combined with collagen promote ECO-mediated osteogenesis36,37.
Here, we present a method for preparing HA hydrogels using bone marrow-derived adult human MSCs and their use for hypertrophic chondrogenesis in vitro and subsequent endochondral ossification in vivo38. We compared the characteristics of HA with those of collagen, a material widely applied in bone tissue engineering with MSCs and a useful material for scaling up artificial grafts for endochondral ossification17. In an immunocompromised mouse model, HA and collagen constructs seeded with human MSCs were evaluated for in vivo ECO potential by subcutaneous implantation. The results show that HA hydrogels are excellent as a scaffold for MSCs to create artificial cartilage grafts that allow bone formation through ECO.
The protocol is divided into two steps. First, constructs of human MSCs seeded on hyaluronan hydrogel are prepared and differentiated into hypertrophic cartilage in vitro. Next, the differentiated constructs are implanted subcutaneously in a nude model to induce endochondral ossification in vivo (Figure 1).

著者スポットライト:血管新生人工軟骨統合による骨再生の強化 

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

Our research intends to develop a method that improves the lack of blood flow and can be applied to large bone defects. The protocol presented here is one with the approaches we have taken to this end. The approach to bone formation using artificial cartilage the structure that mimics the natural process of skeletal development during the embryogenesis.This approach is relatively new in bone regeneration research. The advantage we inducing cartilage neogenesis, which is not an existent method currently used in clinical practice exists for vascularized bone grafts. Traditionally, bone regeneration research has used the techniques that combine stem cells, biomaterials, and growth factors alone or in combination.The method of bone formation by implanting artificial cartilage uses a techniques that makes artificial cartilage by mixing stem cells with biomaterials that serve the scaffolding material, and inducing cartilage differentiation. Healing our patients'bone defect clinically requires a large quantity of high quality artificial cartilage. Our protocol addresses the challenge of producing high quality artificial cartilage, and how to make multiple cartilage fuse with each other to form a unified bone.Our protocol helps generate larger, higher quality cartilage with fewer cells than protocols that use or do not use other scaffold materials to create artificial cartilage. Furthermore, the protocol can generate one integrated piece of bone, even with multiple pieces implanted in vivo. This is important because preparing clinical cartilage of a shape and size that fits the bone defect is impractical.

MSCを内包したHAハイドロゲルを、軟骨形成の誘導因子であるTGFβ3を添加した軟骨形成培地で培養した41 (ステップ4.1)。我々は、HAの特性を、前述のように、軟骨内骨化のためのMSCベースの人工軟骨移植片の作成に有効であることが示されているコラーゲンの特性と比較した38。未分化MSCは、骨形成分化(すなわち、膜内骨化)によって骨を生成...

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間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in vivoでの融合移植片間の血管新生を伴う統合骨の形成に効果的です。

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...

私たちの研究では、血流不足を改善し、大きな骨欠損に適用できる方法を開発したいと考えています。ここで紹介するプロトコルは、この目的のために私たちがとったアプローチの1つです。人工軟骨を用いた骨形成へのアプローチ:胚発生時の骨格発達の自然なプロセスを模倣した構造。このアプローチは、骨再生研究において比較的新しいものです。現在臨床現場で使用されている既存の方法ではない軟骨新生を誘導する利点は、血管新生骨移植に存在します。従来、骨再生研究では、幹細胞、生体材料、成長因子を単独または組み合わせて組み合わせる技術が使用されてきました。人工軟骨を埋め込んで骨を形成する方法は、足場となる生体材料に幹細胞を混合し、軟骨分化を誘導して人工軟骨を作る技術です。患者さんの骨の欠損を臨床的に治すには、高品質の人工軟骨を大量に必要とします。私たちのプロトコルは、高品質の人工軟骨を製造するという課題と、複数の軟骨を互いに融合させて統一された骨を形成する方法に取り組んでいます。私たちのプロトコルは、人工軟骨を作成するために他の足場材料を使用する、または使用しないプロトコルよりも、より少ない細胞でより大きく、高品質の軟骨を生成するのに役立ちます。さらに、このプロトコルは、in vivoに埋め込まれた複数の骨片でも、1つの統合された骨片を生成することができます。骨欠損にフィットする形状とサイズの臨床軟骨を準備することは現実的ではないため、これは重要です。

integrated-bone-formation-through-vivo-endochondral-ossification

Research

JoVE Journal

Biology

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

781 ビュー.  Tokyo Medical and Dental University. 私たちの研究では、血流不足を改善し、大きな骨欠損に適用できる方法を開発したいと考えています。ここで紹介するプロトコルは、この目的のために私たちがとったアプローチの1つです。人工軟骨を用いた骨形成へのアプローチ:胚発生時の骨格発達の自然なプロセスを模倣した構造。このアプローチは、骨再生研究において比較的新しいものです。現在臨床現?...

ビデオ: 著者スポットライト:血管新生人工軟骨統合による骨再生の強化 

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

生物学

Preparation and In Vitro Differentiation of Mesenchymal Stem Cell-Encapsulated Hydrogels for Bone Formation

Begin by trypsinizing the human mesenchymal stem cells to create a cell suspension. Next, aliquot the cell suspension into a 1.5-milliliter tube to create 10 constructs. After centrifuging the suspension at 220g for three minutes, use a vacuum pump to remove the supernatant.Now, place the cell pellet on ice. Next, bring the thiol-modified hyaluronic acid, thiol-reactive crosslinker, polyethylene glycol diacrylate, and degassed water bottles to room temperature. Under sterile conditions, use a needle equipped syringe to add one milliliter of degassed water to the bottle containing hyaluronic acid.Vortex the solution, occasionally heating it to 37 degrees Celsius until it becomes clear. Then, place the solution on ice. Under sterile conditions, add 5 milliliters of degassed water to the crosslinker bottle.Dissolve by inverting repeatedly before placing it on ice. Now, add 120 microliters of the dissolved hyaluronic acid solution to the aliquoted cell pellet and resuspend the cell pellet by pipetting the solution back and forth. Add 30 microliters of the dissolved crosslinker solution into the tube with the resuspended cell pellet.Ensure proper mixing by tapping on the tube. After mixing, briefly spin down the solution. Drop 15 microliters of the combined solution onto a paraffin-coated 24-well plate.Allow it to solidify at 37 degrees Celsius for 30 minutes. For the in vitro differentiation, add 0.5 milliliters of chondrogenic differentiation medium to the cell seated hydrogels. After three weeks, switch to the hypertrophic differentiation medium, adding 0.5 milliliters per well.Chondrogenic differentiation resulted in sulfated glycosaminoglycans in type 2 collagen positive extracellular matrix in both the hyaluronic acid or, HA, and collagen constructs. However, the distribution was more homogenous in the hyaluronic acid constructs. The collagen constructs demonstrated peripheral cells with heterogeneous morphology.The average roundness of cells in the HA constructs was higher than in the collagen constructs. Calcium deposition was detected at the outer edges of both constructs at five weeks. In the in vivo HA constructs, all implants were attached to each other in subcutaneous pockets and formed integrated bone tissue.40%of the in vivo collagen constructs were independent. Osteoid tissue with lamellar morphology was formed in the outer regions of both in vivo constructs at eight weeks post-implantation. Loss of cartilage was also observed in the HA construct.Multiple in vivo HA constructs appeared to form integrated bone tissue as indicated by the connection to the bone tissues and the presence of joint fibrous tissue. While 40%of the collagen constructs were united, the remaining constructs existed apart or were only attached without bony tissue connections. Both constructs showed positively labeled vessels in the bone marrow, and the inner cartilage was surrounded by multinucleated osteoclast cells.The mineral was deposited in the outer osteoid region of both constructs with higher mineral volume and HA constructs due to their larger size.