Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (JSPS) Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (KAKENHI) ile desteklenmiştir. JP19K10259 ve 22K10032'den MAI'ye).

Bu protokolde 4 haftalık çıplak erkek fareler kullanılır. Dört fareyi 22−24 °C ve %50−%70 bağıl nemde 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü altında bir kafeste barındırın. Tüm hayvan deneyleri, Tokyo Tıp ve Diş Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (onay kimliği: A2019-204C, A2020-116A ve A2021-121A).
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>MSC büyüme ortamının ek kitini MSC bazal ortamına ekleyerek mezenkimal kök hücre büyüme ortamını (MSC büyüme ortamı) hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Ortama %10 fetal sığır serumu (FBS), 50 μg/mL gentamisin, 200 μM L-alanil-L-glutamin ve 1 ng/mL bazik fibroblastik büyüme faktörü ekleyerek Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium ve Ham's F12 (DMEM/F-12) ortamını hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Kullanmadan hemen önce DMEM'e %1 ITS-G takviyesi, %0.12 sığır serum albümini, 50 μg/mL gentamisin, 0.35 mM L-prolin, 100 nM deksametazon ve 10 ng/mL TGF-β3 ekleyerek kondrojenik ortam hazırlayın.</li>
	<li>Kullanmadan hemen önce DMEM'e 10 mM β-gliserofosfat, %0.12 sığır serum albümini, 10 nM deksametazon, 200 μM askorbat-2-fosfat, 50 nM L-tiroksin, 50 μg/mL gentamisin ve 50 pg/mL IL-1β ekleyerek hipertrofik ortam hazırlayın.</li>
	<li>24 oyuklu bir kültür kabını, 60 °C'de önceden ısıtılmış 200 μL erimiş parafin ile kaplayın. Parafin ayarlanana kadar oda sıcaklığında bekletin.</li>
</ol>2. İnsan MSC'lerinin genişletilmesi
NOT: Deneylere başlamadan önce, MSC kondrogenezi için yüksek potansiyele sahip MSC'ler,17'de tarif edildiği gibi mikro kitle kültüründe seçilmelidir.
<ol><li>Üreticinin talimatlarına göre, birincil insan kemiği iliği türevi MSC'leri (pasaj 2), %5 CO2 ve %95 nemlendirilmiş hava inkübatöründe 37 ° C'de 5 x 103 hücre/cm2 yoğunlukta 10 cm'lik bir tabakta MSC büyüme ortamı ile kültürleyin.</li>
	<li>Ortamı 2-3 günde bir değiştirin. Hücreler %80-90 birleşmeye ulaştığında, ortamı bir vakum pompası kullanarak hücre kültürü kabından aspire edin, 5 mL PBS ile yıkayın ve ardından çözeltiyi bir vakum pompası ile aspire edin.</li>
	<li>Yemeğe 1 mL %0.05 tripsin /% 0.02 EDTA çözeltisi ekleyin. Çanağı 37 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 1 mL MSC büyüme ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik tüpteki diğer bulaşıklardan birleştirin ve buz üzerinde tutun.</li>
	<li>10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL %0.4 tripan mavisi lekesi ile karıştırarak hücreleri saymak için hücre sayacını kullanın.</li>
	<li>Kalan hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 220 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve mL başına 1.0 x 106 hücre konsantrasyonda kriyoprezervasyon solüsyonu ekleyin.</li>
	<li>Her bir kriyotüpe 1 mL hücre süspansiyonu dağıtın ve sıvı nitrojene aktarmadan önce -80 °C'de 12 saat saklayın. Elde edilen donmuş stoklar (pasaj 3) bu protokol için kullanılır.</li>
	<li>Deneyler için, stoklanmış MSC'leri 10 cm'lik bir tabakta 5 x 103 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın. DMEM / F-12 ortamında% 80 -% 90 birleşene kadar (pasaj 4) kültür hücreleri.</li>
</ol>3. MSC kapsüllü hidrojellerin hazırlanması
<ol><li>Hücreleri tripsinize edin ve 2.3 - 2.6 adımlarında açıklandığı gibi hücre süspansiyonunu hazırlayın.</li>
	<li>10 yapı yapmak için (yapı başına 2.5 x 10 5 hücre), 2.5 x 106 hücre içeren hücre süspansiyonunu1.5 mL'lik bir mikrotüpe ayırın.</li>
	<li>Süspansiyonu 220 x g'de 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı bir vakum pompasıyla çıkarın ve buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Tiyol ile modifiye edilmiş hyaluronik asit (HA), tiyol reaktif çapraz bağlayıcı, polietilen glikol diakrilat ve gazı alınmış su şişelerini oda sıcaklığına getirin.</li>
	<li>Steril koşullar altında, iğneli bir şırınga kullanarak HA içeren şişeye 1.0 mL gazı alınmış su ekleyin (üreticinin talimatlarına bakın).</li>
	<li>Vorteks, çözelti berraklaşana kadar ara sıra 37 ° C'ye kadar ısınır, ardından buzun üzerine yerleştirilir. Katıların tamamen çözünmesi 30 dakikadan az sürer.</li>
	<li>Steril koşullar altında, iğneli bir şırınga kullanarak çapraz bağlayıcı şişesine 0,5 mL gazdan arındırılmış su ekleyin. Birkaç kez ters çevirerek eritin, ardından buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Aliquoted hücre peletine (2.5 x 106 hücre) 120 μL çözünmüş HA çözeltisi ekleyin. İleri geri pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin.</li>
	<li>HA ve hücreleri içeren tüpe 30 μL çözünmüş çapraz bağlayıcı çözeltisi ekleyin (adım 3.8) ve tüpe dokunarak birleştirin ve ardından kısaca döndürün. HA çözeltisini ve çapraz bağlayıcı çözümünü 4:1 oranında birleştirin.</li>
	<li>MSC'ler (2.5 x 105 hücre) içeren kombine çözeltinin 15 μL'sini parafin kaplı 24 oyuklu plakaya damlatın ve 37 °C'de 30 dakika katılaşmasına izin verin (Şekil 2). Yüksek viskozite nedeniyle, gerekenden en az %10 daha fazla hücre/hidrojel karışımı hazırlayın. NOT: Hidrojelin özellikleri daha önce açıklanmıştır39.</li>
</ol>4. İn vitro farklılaşma koşulları
<ol><li>MSC tohumlu HA hidrojellerin bir yapısına 0.5 mL kondrojenik farklılaşma ortamı ekleyin. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin.</li>
	<li>3 hafta sonra, hipertrofik farklılaşma ortamına (oyuk başına 0.5 mL) geçin ve yapıları 2 hafta daha kültürleyin.</li>
</ol>5. MSC'lerin in vivo implantasyonu
<ol><li>Toplam 5 haftalık in vitro kültürden sonra, yapıları daha önce tarif edildiği gibi çıplak farelerin arkasına deri altından implante edin38,40.</li>
	<li>Fareleri tartın ve 0.75 mg / kg vücut ağırlığı (b.w.) medetomidin, 4.0 mg / kg b.w. midazolam ve 5.0 mg / kg b.w. tarif edildiği gibi intraperitoneal enjeksiyon ile butorphanol38.</li>
	<li>Cerrahi uyaranlara hareketsiz kalarak yeterli anesteziyi doğrulayın ve ameliyat sırasında periyodik olarak yavaş, düzenli göğüs hareketleri ve pembe mukozanın rengine göre uygun oksijen kaynağı ile solunum derinliğini izleyin. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhemi kullanın.</li>
	<li>Fareyi yüzüstü pozisyonda steril bir cerrahi örtü üzerine yerleştirin, insizyon bölgesini 50 ppm hipokloröz asitli su (pH 5.0; HAW) ve farenin üzerine delikli bir cerrahi örtü yerleştirin. NOT: Tüm cerrahi malzemeleri bir otoklav, etilen oksit gazı veya HAW içinde sterilize edin. Cerrahlar parmaklarını yıkamalı ve cerrahi önlük ve eldiven giymelidir.</li>
	<li>Makas kullanarak omurganın orta çizgisi boyunca omuz ve kalça bölgelerinde 2 cm aralıklarla 5 mm uzunluğunda iki cilt kesisi yapın.</li>
	<li>Deri altı bir cep oluşturmak için insizyondan deri altından bir spatula yerleştirin.</li>
	<li>Forseps ile her cebe iki ila üç yapı (her biri ~ 15 μL, adım 5.1) yerleştirin. Aynı cebe implante edilen HA yapıları çok sık füzyona eğilimlidir. Füzyonu önlemek için, her cebe bir HA yapısı yerleştirin.</li>
	<li>Kesiler 4-0 örgülü ipek dikişlerle kapatılır. Fareye 0.75 mg / kg b.w. atipamezol tarif edildiği gibi38.</li>
	<li>Fareler anesteziden kurtulurken, fareleri yiyecek ve su şişeleri olmadan steril zemin yatakları içeren steril kurtarma kafeslerine yerleştirin ve vücut ısısını, nabzı ve solunumu sürekli olarak izleyin.</li>
	<li>Sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareleri gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileştikten sonra, hayvanları diğer hayvanlarla birlikte üreme odasına geri koyun.</li>
	<li>Olası komplikasyonlar için iyileşme döneminde hayvanları birkaç günde bir izleyin. İmplantasyondan 4 ve 8 hafta sonra çok az acı çekerek fareleri karbondioksit soluyarak ötenazi yapın.</li>
	<li>Aşılı bölgelerdeki cildi kesin ve implante edilen yapıları forseps ile çıkarın. Yapıları 16 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve ardından analize tabi tutun.</li>
</ol>6. İstatistiksel analiz
<ol><li>Nicel verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak raporlayın. Ticari yazılım kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin.</li>
	<li>Gruplar arasındaki anlamlı farklılıkları belirlemek için Student t-testi veya tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi kullanılmıştır. p<0.05 ve p<0.01 iki grup arasında anlamlı farklılıklar olduğunu göstermektedir.</li>
</ol>

Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Kemik Rejenerasyonu için Yapay Kıkırdak İmplantları

Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Hipertrofik kıkırdaktan kemiğe geçişi destekleyen uygun iskele materyallerinin kullanılması, MSC bazlı tasarlanmış hipertrofik kıkırdak greftlerini büyütmek ve klinik olarak anlamlı boyuttaki kemik kusurlarını tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, HA'nın in vitro olarak MSC bazlı hipertrofik kıkırdak dokusunun farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel bir iskele materyali olduğunu gösteriyoruz <sup cl...

Otolog kemik, travma, konjenital defektler ve cerrahi rezeksiyona bağlı kemik defektlerinin onarımında hala altın standarttır. Bununla birlikte, otojen kemik greftinin donör ağrısı, enfeksiyon riski ve hastalardan izole edilebilecek sınırlı kemik hacmi gibi önemli sınırlamaları vardır 1,2,3,4. Doğal veya sentetik polimerleri kalsiyum fosfat veya hidroksiapatit 5,6 gibi mineralize malzemelerle birleştiren kemik ikameleri olarak çok sayıda biyomalzeme geliştirilmiştir. Bu mühendislik malzemelerinde kemik oluşumu, kök hücrelerin zar içi kemikleşme (IMO) işlemi yoluyla doğrudan osteoblastlara farklılaşmasına izin vermek için genellikle mineralize malzeme bir astar malzemesi olarak kullanılarak elde edilir7. Bu işlem anjiyojenik adımdan yoksundur, bu da implantasyondan sonra greftin yetersiz in vivo vaskülarizasyonuna neden olur 8,9,10 ve bu nedenle, böyle bir işlemi kullanan yaklaşımlar büyük kemik kusurlarını tedavi etmek için optimal olmayabilir 11.
Gelişim sırasında iskeletogenezde doğuştan gelen bir mekanizma olan endokondral ossifikasyon (ECO) sürecini özetlemek için uygulanan stratejilerin, geleneksel IMO tabanlı yaklaşımlarla ilişkili önemli sorunların üstesinden geldiği gösterilmiştir. EKO'da, kıkırdak şablonundaki kondrositler, vasküler infiltrasyonu ve kıkırdak şablonunun kemiğe yeniden şekillenmesini destekleyen vasküler endotelyal büyüme faktörünü (VEGF) serbest bırakır12. Kırık onarımı sırasında da aktive olan kıkırdak yeniden şekillenmesi ve anjiyogenez yoluyla osteogeneze ECO aracılı yaklaşım, MSC'lerden türetilen yapay olarak oluşturulmuş kıkırdak dokusunu bir astar materyali olarak kullanır. Kondrositler kemik defektlerinde hipoksiyi tolere edebilir, anjiyogenezi indükleyebilir ve vasküler serbest kıkırdak greftini anjiyojenik dokuya dönüştürebilir. Çok sayıda çalışma, MSC bazlı kıkırdak greftlerinin böyle bir ECO programı uygulayarak in vivo kemik ürettiğini bildirmiştir 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulaması için temel bir gereklilik, klinik ortamda istenen miktarda kıkırdak greftinin nasıl hazırlanacağıdır. Gerçek kemik defektine uyan boyutta klinik kıkırdak hazırlamak pratik değildir. Bu nedenle, greft kıkırdağı, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturmalıdır22. Hidrojeller, endokondral kemikleşme için doku mühendisliği yapılmış greftlerin ölçeklendirilmesi için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo ECO 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Bununla birlikte, klinik uygulama gereksinimlerini karşılamak için en uygun destek materyali belirlenememiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak33'ün hücre dışı matrisinde bulunan biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. HA, kondrojenik farklılaşmayı desteklemek için CD44 gibi yüzey reseptörleri aracılığıyla MSC'lerle etkileşime girer 25,26,28,30,31,32,34. Ek olarak, HA iskeleleri, insan diş pulpası kök hücrelerinin35 IMO aracılı osteojenik farklılaşmasını teşvik eder ve kollajen ile birleştirilen iskeleler, ECO aracılı osteogenezi36,37 destekler.
Burada, kemik iliğinden türetilmiş yetişkin insan MSC'leri kullanılarak HA hidrojellerinin hazırlanması ve bunların in vitro hipertrofik kondrogenez ve ardından endokondral ossifikasyon için kullanımı için bir yöntem sunuyoruz in vivo38. HA'nın özelliklerini, kemik dokusu mühendisliğinde MSC'lerle yaygın olarak uygulanan bir malzeme olan ve endokondral ossifikasyon için yapay greftlerin ölçeklendirilmesi için yararlı bir malzeme olan kollajen ile karşılaştırdık17. İmmün sistemi baskılanmış bir fare modelinde, insan MSC'leri ile tohumlanan HA ve kollajen yapıları, deri altı implantasyon ile in vivo ECO potansiyeli açısından değerlendirildi. Sonuçlar, HA hidrojellerinin, MSC'lerin ECO yoluyla kemik oluşumuna izin veren yapay kıkırdak greftleri oluşturması için bir iskele olarak mükemmel olduğunu göstermektedir.
Protokol iki adıma ayrılmıştır. İlk olarak, hyaluronan hidrojel üzerine tohumlanan insan MSC'lerinin yapıları hazırlanır ve in vitro olarak hipertrofik kıkırdağa farklılaştırılır. Daha sonra, farklılaşmış yapılar, in vivo endokondral ossifikasyonu indüklemek için çıplak bir modelde deri altına implante edilir (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13571-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker</td>
			<td>GC Lymphotec</td>
			<td>CS-02-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic fibroblastic growth factor</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>RCHEOT002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>012-23881</td>
			<td>7.5 w/v%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Domitor</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dormicum</td>
			<td>Astellas Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6429</td>
			<td>high glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>1676045</td>
			<td>&#160;10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haccpper Generator</td>
			<td>TechnoMax</td>
			<td>CH-400-5QB</td>
			<td>50 ppm hypochlorous acid water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyStem Cell Culture Scaffold Kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HYS020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#223;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-G supplement</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>090-06741</td>
			<td>&#215;100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>016-21841</td>
			<td>200mmol/L (&#215;100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29001-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Thyroxine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 
			BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>165-13375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS / pH7.4 100ml</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-2051-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;3&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>HZ-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>Meiji Seika Kaisha</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiocare Ointment</td>
			<td>SAVAVET/SAVA Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>048-34332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated bone formation through in vivo endochondral ossification using mesenchymal stem cells

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) kullanılarak yapılan konvansiyonel kemik rejenerasyon tedavisinin, anjiyogenezi indükleyecek bir mekanizmaya sahip olmadığı için kritik boyuttan daha büyük kemik defektlerine uygulanması zordur. MSC'lerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesi, endokondral ossifikasyon (ECO) yoluyla in vivo anjiyogenez ve kemik oluşumunu indükler. Bu nedenle, bu EKO aracılı yaklaşım gelecekte umut verici bir kemik rejenerasyon tedavisi olabilir. Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulamasının önemli bir yönü, kemik defektini onarmak için implante edilecek yeterli kıkırdağın hazırlanması için bir protokol oluşturmaktır. Gerçek kemik defektinin şekline uyan boyutta tek bir greftli kıkırdak kütlesi tasarlamak özellikle pratik değildir. Bu nedenle, nakledilecek kıkırdak, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturma özelliğine sahip olmalıdır. Hidrojeller, klinik gereksinimleri karşılamak için endokondral kemikleşme için doku mühendisliği greftlerini büyütmek için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro olarak MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo olarak ECO'yu desteklese de, klinik uygulamaların ihtiyaçlarını karşılamak için en uygun iskele malzemesi henüz belirlenmemiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak hücre dışı matrisinin çok önemli bir bileşenidir ve biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. Burada, HA hidrojellerinin, MSC bazlı kıkırdak dokusunun in vitro farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel özelliklere sahip olduğunu gösteriyoruz.

Autologous bone is still the gold standard for repairing bone defects due to trauma, congenital defects, and surgical resection. However, autogenous bone grafting has significant limitations, including donor pain, risk of infection, and limited bone volume that can be isolated from the patients1,2,3,4. Numerous biomaterials have been developed as bone substitutes, combining natural or synthetic polymers with mineralized materials such as calcium phosphate or hydroxyapatite5,6. Bone formation in these engineered materials is usually achieved using the mineralized material as a priming material to allow stem cells to differentiate directly into osteoblasts through the intramembrane ossification (IMO) process7. This process lacks the angiogenic step, resulting in insufficient in vivo vascularization of the graft after implantation8,9,10, and therefore, approaches using such a process may not be optimal for treating large bone defects11.
Strategies applied to recapitulate the endochondral ossification (ECO) process, an innate mechanism in skeletogenesis during development, have been shown to overcome significant problems associated with traditional IMO-based approaches. In ECO, chondrocytes in the cartilage template release vascular endothelial growth factor (VEGF), which promotes vascular infiltration and remodeling of the cartilage template into bone12. The ECO-mediated approach to osteogenesis via cartilage remodeling and angiogenesis, which is also activated during fracture repair, uses artificially created cartilage tissue derived from MSCs as a priming material. Chondrocytes can tolerate hypoxia in bone defects, induce angiogenesis, and convert a vascular-free cartilage graft into angiogenic tissue. Numerous studies have reported that MSC-based cartilage grafts generate bone in vivo by implementing such an ECO program13,14,15,16,17,18,19,20,21.
An essential requirement for the clinical application of this ECO-mediated approach is how to prepare the desired amount of cartilage graft in a clinical setting. Preparing clinical cartilage of a size that fits the actual bone defect is not practical. Therefore, graft cartilage must form bone integrally when multiple fragments are implanted22. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification. Many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; however, the optimal support material to meet the clinical application requirements has remained undetermined. Hyaluronic acid (HA) is a biodegradable and biocompatible polysaccharide present in the extracellular matrix of cartilage33. HA interacts with MSCs via surface receptors such as CD44 to support chondrogenic differentiation25,26,28,30,31,32,34. In addition, HA scaffolds promote IMO-mediated osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells35, and scaffolds combined with collagen promote ECO-mediated osteogenesis36,37.
Here, we present a method for preparing HA hydrogels using bone marrow-derived adult human MSCs and their use for hypertrophic chondrogenesis in vitro and subsequent endochondral ossification in vivo38. We compared the characteristics of HA with those of collagen, a material widely applied in bone tissue engineering with MSCs and a useful material for scaling up artificial grafts for endochondral ossification17. In an immunocompromised mouse model, HA and collagen constructs seeded with human MSCs were evaluated for in vivo ECO potential by subcutaneous implantation. The results show that HA hydrogels are excellent as a scaffold for MSCs to create artificial cartilage grafts that allow bone formation through ECO.
The protocol is divided into two steps. First, constructs of human MSCs seeded on hyaluronan hydrogel are prepared and differentiated into hypertrophic cartilage in vitro. Next, the differentiated constructs are implanted subcutaneously in a nude model to induce endochondral ossification in vivo (Figure 1).

Yazar Spotlight: Vaskülarize Yapay Kıkırdak Entegrasyonu ile Kemik Rejenerasyonunun Artırılması 

Mezenkimal Kök Hücreler Kullanılarak İn Vivo Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Entegre Kemik Oluşumu

Our research intends to develop a method that improves the lack of blood flow and can be applied to large bone defects. The protocol presented here is one with the approaches we have taken to this end. The approach to bone formation using artificial cartilage the structure that mimics the natural process of skeletal development during the embryogenesis.This approach is relatively new in bone regeneration research. The advantage we inducing cartilage neogenesis, which is not an existent method currently used in clinical practice exists for vascularized bone grafts. Traditionally, bone regeneration research has used the techniques that combine stem cells, biomaterials, and growth factors alone or in combination.The method of bone formation by implanting artificial cartilage uses a techniques that makes artificial cartilage by mixing stem cells with biomaterials that serve the scaffolding material, and inducing cartilage differentiation. Healing our patients'bone defect clinically requires a large quantity of high quality artificial cartilage. Our protocol addresses the challenge of producing high quality artificial cartilage, and how to make multiple cartilage fuse with each other to form a unified bone.Our protocol helps generate larger, higher quality cartilage with fewer cells than protocols that use or do not use other scaffold materials to create artificial cartilage. Furthermore, the protocol can generate one integrated piece of bone, even with multiple pieces implanted in vivo. This is important because preparing clinical cartilage of a shape and size that fits the bone defect is impractical.

MSC kapsüllü HA hidrojeller, kondrogenez41'in bir indükleyicisi olan TGFβ3 ile takviye edilmiş kondrojenik ortamda kültürlendi (adım 4.1). HA'nın özelliklerini, daha önce tarif edildiği gibi, endokondral kemikleşme için MSC bazlı yapay kıkırdak greftleri oluşturmada etkili olduğu gösterilen kollajen özellikleriyle karşılaştırdık38. Farklılaşmamış MSC'ler bu çalışmaya negatif kontroller olarak dahil edilmemiştir, çünkü farklılaşmamış ...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration at JoVE.com

Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...

Araştırmamız, kan akışı eksikliğini iyileştiren ve büyük kemik kusurlarına uygulanabilecek bir yöntem geliştirmeyi amaçlamaktadır. Burada sunulan protokol, bu amaçla benimsediğimiz yaklaşımlarla bir tanesidir. Embriyogenez sırasında iskelet gelişiminin doğal sürecini taklit eden yapı olan yapay kıkırdak kullanarak kemik oluşumuna yaklaşım.Bu yaklaşım kemik rejenerasyonu araştırmalarında nispeten yenidir. Şu anda klinik pratikte kullanılan bir yöntem olmayan kıkırdak neogenezisini indüklememizin avantajı vaskülarize kemik greftleri için mevcuttur. Geleneksel olarak, kemik rejenerasyon araştırmaları, kök hücreleri, biyomalzemeleri ve büyüme faktörlerini tek başına veya kombinasyon halinde birleştiren teknikleri kullanmıştır.Yapay kıkırdak implante ederek kemik oluşturma yöntemi, kök hücreleri iskele malzemesine hizmet eden biyomalzemelerle karıştırarak ve kıkırdak farklılaşmasını indükleyerek yapay kıkırdak yapan bir teknik kullanır. Hastalarımızın kemik kusurunu klinik olarak iyileştirmek, büyük miktarda yüksek kaliteli yapay kıkırdak gerektirir. Protokolümüz, yüksek kaliteli yapay kıkırdak üretmenin zorluğunu ve birleşik bir kemik oluşturmak için birden fazla kıkırdağın birbiriyle nasıl kaynaşacağını ele almaktadır.Protokolümüz, yapay kıkırdak oluşturmak için diğer iskele malzemelerini kullanan veya kullanmayan protokollerden daha az hücreyle daha büyük, daha kaliteli kıkırdak oluşturmaya yardımcı olur. Ayrıca, protokol, in vivo implante edilmiş birden fazla parça olsa bile, entegre bir kemik parçası oluşturabilir. Bu önemlidir, çünkü kemik defektine uyan bir şekil ve boyutta klinik kıkırdak hazırlamak pratik değildir.

integrated-bone-formation-through-vivo-endochondral-ossification

Research

JoVE Journal

Biology

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

781 Görüntüleme.  Tokyo Medical and Dental University. Araştırmamız, kan akışı eksikliğini iyileştiren ve büyük kemik kusurlarına uygulanabilecek bir yöntem geliştirmeyi amaçlamaktadır. Burada sunulan protokol, bu amaçla benimsediğimiz yaklaşımlarla bir tanesidir. Embriyogenez sırasında iskelet gelişiminin doğal sürecini taklit eden yapı olan yapay kıkırdak kullanarak kemik oluşumuna yaklaşım.Bu yaklaşım kemik rejenerasyonu araştırmalarında nispeten yenidir. Şu anda klinik pratikte kullanılan bir yönte...

Video: Yazar Spotlight: Vaskülarize Yapay Kıkırdak Entegrasyonu ile Kemik Rejenerasyonunun Artırılması 

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

Biyoloji

Preparation and In Vitro Differentiation of Mesenchymal Stem Cell-Encapsulated Hydrogels for Bone Formation

Begin by trypsinizing the human mesenchymal stem cells to create a cell suspension. Next, aliquot the cell suspension into a 1.5-milliliter tube to create 10 constructs. After centrifuging the suspension at 220g for three minutes, use a vacuum pump to remove the supernatant.Now, place the cell pellet on ice. Next, bring the thiol-modified hyaluronic acid, thiol-reactive crosslinker, polyethylene glycol diacrylate, and degassed water bottles to room temperature. Under sterile conditions, use a needle equipped syringe to add one milliliter of degassed water to the bottle containing hyaluronic acid.Vortex the solution, occasionally heating it to 37 degrees Celsius until it becomes clear. Then, place the solution on ice. Under sterile conditions, add 5 milliliters of degassed water to the crosslinker bottle.Dissolve by inverting repeatedly before placing it on ice. Now, add 120 microliters of the dissolved hyaluronic acid solution to the aliquoted cell pellet and resuspend the cell pellet by pipetting the solution back and forth. Add 30 microliters of the dissolved crosslinker solution into the tube with the resuspended cell pellet.Ensure proper mixing by tapping on the tube. After mixing, briefly spin down the solution. Drop 15 microliters of the combined solution onto a paraffin-coated 24-well plate.Allow it to solidify at 37 degrees Celsius for 30 minutes. For the in vitro differentiation, add 0.5 milliliters of chondrogenic differentiation medium to the cell seated hydrogels. After three weeks, switch to the hypertrophic differentiation medium, adding 0.5 milliliters per well.Chondrogenic differentiation resulted in sulfated glycosaminoglycans in type 2 collagen positive extracellular matrix in both the hyaluronic acid or, HA, and collagen constructs. However, the distribution was more homogenous in the hyaluronic acid constructs. The collagen constructs demonstrated peripheral cells with heterogeneous morphology.The average roundness of cells in the HA constructs was higher than in the collagen constructs. Calcium deposition was detected at the outer edges of both constructs at five weeks. In the in vivo HA constructs, all implants were attached to each other in subcutaneous pockets and formed integrated bone tissue.40%of the in vivo collagen constructs were independent. Osteoid tissue with lamellar morphology was formed in the outer regions of both in vivo constructs at eight weeks post-implantation. Loss of cartilage was also observed in the HA construct.Multiple in vivo HA constructs appeared to form integrated bone tissue as indicated by the connection to the bone tissues and the presence of joint fibrous tissue. While 40%of the collagen constructs were united, the remaining constructs existed apart or were only attached without bony tissue connections. Both constructs showed positively labeled vessels in the bone marrow, and the inner cartilage was surrounded by multinucleated osteoclast cells.The mineral was deposited in the outer osteoid region of both constructs with higher mineral volume and HA constructs due to their larger size.