我々は、解剖のビデオを編集すると援助のために私たちの手順とロドニーマクフェイル（生物科学科、パデュー大学）の撮影にライアンManeri（ミヤコドリプロダクション、LLC）に感謝したいと思います。スーターのラボでの研究は、パデュー大学のNIH（R01 NS049233）とBindleyバイオサイエンスセンターからDMSへの補助金によってサポートされています

ソリューション<ul><li> L15 - ASWの細胞培養培地（1リットル） <ul><li> L15粉末1袋</li><li> H 2 O超純800mlを追加する</li><li> NaClを400mMの</li><li>し、MgSO 4 27 mMの</li><li>のMgCl 2 28 mMの</li><li> L -グルタミン4 mMの</li><li>ゲンタマイシン50μg/ mlの</li><li> HEPES 5mMの</li><li> pHを7.9に調整する</li><li>ドロップのCaCl 2 9.3 mMの（沈殿物と停止する）ことで、ドロップを追加します。 </li><li> 1リットルにH 2 Oの超高純度を追加</li><li>浸透圧計で浸透圧（950-1000ミリモル/ kg）を確認してください（蒸気圧、Wescor＃5520） </li><li>正圧ろ過ユニット（：ミリポアのSVGV010RSフィルタ）を用いて0.22μmのフィルター</li><li>最大1ヶ月、4℃で保存する</li></ul></li><li>ポリ- L -リジン（70から150 kD）の滅菌H 2 O超純で200μg/ mlのストック溶液は-20 ° Cの保管</li><li> 0.5 M MgCl 2溶液</li></ul> 1日目：アメフラシ腹部神経節の解剖酵素的解離溶液の調製<ol><li>エッペンドルフチュー​​ブに：ディスパーゼ酵素（LS02111ワーシントン、猫）の90〜10 mgを量り</li><li> L15 - ASWの培養液900μlを加え、そして滅菌H 2 O超純100μlの</li><li>室温で混合し、場所（RT） </li></ol>腹部神経節の解剖<ol><li> 0.5 MのMgCl 2溶液と50 mlの注射器を埋める。 </li><li>タンクから一匹を取る、動物のインクの防御反応を避けるために、優しく扱う。 </li><li>右から左に、尾側に解剖基板の側にアメフラシ （発泡スチロールボード）、吻側側に置きます。 </li><li>ちょうど頭の後ろに動物に針を挿入し、体腔内にすべてのMgCl 2溶液を注入する。 </li><li>ゆっくりと体の空洞を通してMgCl 2溶液を分散させるために動物をこすり、完全に麻酔になる動物の数分間待つ。 </li><li> 2本の針で解剖ボードに動物の頭と尾をピン。 </li><li>側に大きな開口部を作るために頭と尾に向かって大きなハサミで皮膚と筋肉の層を切って、皮膚を​​持ち上げるために鉗子を使用してください。 </li><li>ブラシ状卵巣下の腹部神経節を見つける。腹部神経節の前に約1cmの接続の神経を保持するための鉗子を使用して、鉗子保持位置の前で、腹部神経節の後ろに解剖はさみで神経を切断。 </li><li> 22℃15〜16時間ディスパーゼソリューションとインキュベートへの場所の神経節℃の温度制御水浴を使用して。 </li></ol> 2日目：アメフラシの袋細胞のめっきポリ-リジンでコーティングされたカバースリップの準備<ol><li>フローベンチでは、4ミリリットルL15 - ASW媒体それぞれで埋める、神経節の解剖の作業皿として3 35ミリメートルのペトリ皿を準備する。ディスパーゼ溶液から消化の15.5時間後に働く料理の一つに腹部神経節を転送する。 </li><li>鉗子を使用すると、エタノールで保存されている＃1.5カバースリップ（22x22 mm）を酸洗浄を行う、アルコールを削除し、ブンゼンのバーナーを介して簡単にそれらを燃えることによってカバースリップを滅菌する。培養皿にカバースリップを配置する前にそれらを簡潔に冷ます。 </li><li>ブンゼンバーナー（短時間だけ火炎プラスチックの溶融を回避するために！）に黄色の先端を曲げることにより湾曲したメッキの先端を準備。 </li><li>滅菌H 2 O超純で200μg/ mlのストック溶液を希釈し、20μg/ mlのポリ-リジン溶液の適当量を準備します。 </li><li> 20μg/ mlのポリ-リジン、室温で20分間インキュベートの500μlと各カバースリップをカバー。 </li><li> 500μlの滅菌H 2 O超純ごとに各カバースリップ3-5回洗浄する。 </li><li>カバーグラスから水を取り除く。L15 - ASW培地4mlで各皿を埋める。 </li></ol>袋の細胞の解離<ol><li>解剖顕微鏡下で、予め95％エタノール（図1ライン1）で洗浄half使用して解剖ハサミとピンセットで腹部神経節をカット。 </li><li>神経節の半分で、袋の細胞のクラスターとhemiganglion細胞（図1ライン、2）との間で切断し、袋の細胞（図1 3行目）の反対側の残りの神経の拡張子を切り取る。一度に神経節の半分で動作する、最初のクラスタからの細胞が播種されている間に皿に残りの半分を残す。 </li><li> two鉗子を（または1つの鉗子と解剖鋏）を使用して、袋のセルのクラスタを囲む結合組織鞘を脇にプッシュすることでバッグの細胞クラスターを離します。必要に応じて解剖用鋏と結合組織を切り取る。このプロセスの間にあまりにも多くのバッグの細胞クラスターを圧迫し、触れないように注意してください。 </li><li>ほとんどの結合組織のが削除されるとき、bを転送以前の準備曲がった黄色の先端を使用して新しい作業皿にAGの細胞クラスター。袋のセルのクラスタが黄色の先端内に閉じ込めたり、空気/媒質界面で立ち往生するように注意してください。 </li><li>個々の袋の細胞を除去するために黄色の先端を使用してクラスタをひいて粉にする。先端のうちにクラスタをピペッティングすることによって行います。低せん断力から始め、必要に応じて力を増加させる。あまりにも多くの細胞を殺すことなく、神経細胞を除去するために必要な最小の力を常に使用します。 </li><li> 3月5日健康な袋の細胞を収集し、ポリリジンコートしたカバースリップで皿に移す。死細胞（彼らは中央の黒/透明な）と結合組織の破片を拾うことは避けてください。 </li><li>手順6を繰り返します。とそれぞれのカバーの中央に約15-25のライブニューロンを配置。死んだ細胞や破片も同様に転送される場合、それを拾ったり、健康な細胞から、それを吹き飛ばすことによって不要な物質を取り除く。このプロセスは、両方のクラスタのために約2-3時間かかります。 </li><li>一度（不要な振動を避けるために、送風機、フローベンチをオフにしておく）細胞がアタッチできるように室温で少なくとも2時間の流れのベンチ上で培養皿を保つ終えた。 </li><li> 14℃で一晩、またはさらに使用するまでインキュベーターに皿を置きます。成長円錐は、40〜10時間で開発することがあります。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="図1。アメフラシカリフォルニ腹部神経節の概略図。袋のセルクラスタを入手するために切る場所の色の線が示している。" /> 図1。 アメフラシカリフォルニ腹部神経節の概略図。袋のセルクラスタを入手するために切る場所の色の線が示している。 3日目：アメフラシの袋の細胞のライブイメージングのためのチャンバーを設定するイメージングチャンバーの組立<ol><li>ライブセルイメージングの実験のために袋の細胞を使用する前に、低消費電力の顕微鏡で細胞を検査する。細胞が健全な成長円錐を開発していない場合は、新鮮な培地を供給し、1〜2時間室温で残す。 </li><li>新鮮L15 - ASW培地でプレートを供給するため、真空ラインで古い培地の半分（〜2ミリリットル）を削除し、ペトリ皿あたりの新しいL15 - ASW培地2 mlを加える。これはカバースリップからセルを削除するので、完全に、すべてを一度に皿からすべてのメディアを削除しないことが重要です。 </li><li>袋のセルイメージングのために、我々は2つ​​のカバースリップとイメージングチャンバーのようなサンドイッチの2つのプラスチック製スペーサを組み立てます。サンドイッチのトップカバースリップは、培地および試薬の交換が簡単にできるように短くカットされます。組み立て中に、接続されている袋の細胞とカバーガラスを外れから細胞を防止するために常にL15 - ASWの培地に浸漬する必要があります。 </li><li>室を準備するには、カットオフ〜2mmのダイヤモンドペン（ガラスカッター）と定規で第1位カバースリップ22x22 mmの右側から。 </li><li> 1 mlのシリンジを使用して、短いカバーの両側に高真空グリースを適用し、それぞれの側にプラスチック製スペーサを取り付けます。両方スペーサーの上部に真空グリースを塗布してください。 </li><li>カバーガラスの袋の細胞を含むペトリ皿にカバーガラスとスペーサーの組み立て、および場所を反転させる。合わせ、ゆっくりと二つのQ -チップの逆の端と底部カバーに上部カバースリップスティックを押し下げ。 </li><li>鉗子を使用して、静かに漏れる媒体なしペトリ皿のサンドイッチアセンブリを持ち上げます。必要に応じて、二つのカバーグラスを合わせ、キムワイプで余分な培地を拭き取ってください。顕微鏡のスライドホルダーの底部分の上にサンドイッチを置き、クリップを使って慎重にカバーを取り付けます。 </li><li> Q -チップとサンドイッチの上面の中央をきれいにガラスクリーナー（スパークルは、ガラスクリーナーとして使用されている）でdabbed。すぐにストリーク線を避けるために2番目、乾いた綿棒でガラスクリーナーをふいて乾かす。ボトムカバースリップについても同じ操作を行います。ストリークラインの清浄なカバーガラスは、高品質の画像処理のために重要である。 </li></ol>顕微鏡での袋の細胞 アメフラシの袋の細胞ニューロン培養は、低密度であるのであなたの顕微鏡のセットアップは、細胞間の切り替え容易にするために、ステージの位置決め機能を持っている場合、それが最善です。袋の細胞は容易にイメージング実験中にステージ上で数時間室温に保つことができる。蒸発を防ぐために定期的に培地を交換する。

<ol>
	<li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons.">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li><li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule,+apCAM,+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling.">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li><li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones.">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li><li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering.">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li></ol>

アメフラシの袋セルのニューロンは非常に少数の非神経細胞に血清を含まない神経細胞培養系を提供しています。これらのニューロンは、重要な細胞生物学的な質問の数に対応するために適切な非常に大きな成長円錐を形成します。袋のセルのニューロンは、簡単に数時間かけて室温で操作して撮像することができます。蛍光を使用することで、1つは、定量的にF -アクチンと微小管の重合と転座のダイナミ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>#1 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>48366067</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#1.5 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>2870-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm Petri dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filters for medium filtration</td>
<td>Tool</td>
<td>Millipore</td>
<td>SVGV010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High vacuum grease</td>
<td>Tool</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Osmometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Wescor</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic shims</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts Inc </td>
<td>SHSP-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>C79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15 medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41300-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8540</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>5958-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>6070-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine (70-150 kD) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt </td>
<td>7581</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutral Protease (Dispase)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Worthington</td>
<td>LS02111</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neuronal cell cultures from aplysia for high-resolution imaging of growth cones

神経成長円錐は、環境で指導の手がかりを検出し、適切な標的細胞に向けて方向性に、この情報を伝達することができる軸索の先端に非常に運動性構造です。完全なガイダンス情報が細胞表面から基盤となる動的な細胞骨格ネットワークに送信する方法を理解するためには、高い時間および空間分解能でのタンパク質の動態の生細胞イメージングに適したモデル系が必要です。典型的な脊椎動物の成長円錐は、定量的にF -アクチンと微小管のダイナミクスを分析するには小さすぎます。アメフラシアメフラシカリフォルニから神経細胞は、脊椎動物の神経細胞よりも5〜10倍も大きいです簡単に室温に保つことができるとマイクロマニピュレーションと生物物理学的測定のための非常に堅牢な細胞である。彼らの成長円錐は、非常に細胞質領域とも上述の細胞骨格系を定義している。神経細胞体は、成長円錐の運動性と指導を​​研究するためのプローブの様々なマイクロインジェクションすることができます。現在のプロトコルでは、腹部神経節の郭清のための手順を示す袋の細胞の神経細胞の培養と成長円錐の生細胞イメージングのためのイメージングチャンバーを設定。

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Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

アメフラシカリフォルニのニューロンは、成長円錐の運動性と指導の高分解能イメージングのための優れている文化の中で大きな成長円錐を開発する。ここでは、アメフラシの袋の細胞ニューロンの解剖やメッキ用だけでなく、生細胞イメージングのためのチャンバーを設定するためのプロトコルを提示する。

成長円錐の高分解能イメージングのためのアメフラシから神経細胞の培養

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

neuronal-cell-cultures-from-aplysia-for-high-resolution-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K ビュー.  Purdue University. アメフラシカリフォルニのニューロンは、成長円錐の運動性と指導の高分解能イメージングのための優れている文化の中で大きな成長円錐を開発する。ここでは、アメフラシの袋の細胞ニューロンの解剖やメッキ用だけでなく、生細胞イメージングのためのチャンバーを設定するためのプロトコルを提示する。

ビデオ: Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

生物学

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

ラットの脾細胞からT細胞増殖因子の準備

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

アダルトキイロショウジョウバエのロコモーションの高解像度のビデオトラッキング

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

の準備アメフラシ感覚運動神経細胞の培養

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

で微小管ダイナミクスを測定するためにplusTipTrackerソフトウェアを使用した<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;成長円錐

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...