PHSのグラント（MH51393）は、この作業を支持した。我々が使用するアメフラシの一部は研究資源は、NIHのナショナルセンターからの助成金RR10294下マイアミ大学のアメフラシのための国家リソースによって提供されています。

1。準備<ol><li> 75〜100ミリリットル等張塩化マグネシウム溶液を注入することにより、動物を麻酔。我々はイメージングのために使用アメフラシは、一般的に 150〜200グラムあり、Marinus Scientificから得られる。 </li><li>ワックス覆われた皿に麻酔動物をピン。注射針は、この目的のためによく働く。無菌テクニックは必要ありません。総鉗子および標準はさみを使用すると、動物の足の切開を行い、口腔内の質量を公開します。頬神経の位置を確認します。すべて頬神経を切断することによって春のはさみと微鉗子、慎重にフリー神経節を使用しています。 </li><li>神経節を取り出して、人工海水を含むシルガードコートディッシュに入れてください。神経を安定させるために頬の神経が通っていくつかの昆虫ピンを配置。 Desheath細胞内記録のためのニューロンを公開するために極細鉗子と春のはさみ、ようを使って頬の神経節。その後、約15細かい虫（minを使用して再ピンガングリオンutien）ピン。どんな動きが撮像中に問題となるような神経は、所定の位置にしっかりと保持されなければならない。 </li></ol> 2。電極を準備<ol><li>フィラメント（例えばWPI TW100F-4）とプラー付きガラスキャピラリーチューブを用いて電極を引き出します。設定は、個々に必要な抵抗の電極を作成するために決定されるべきである。電極は面取り工程を省略した場合面取り、または約5 Mオームされる場合は、3MのKAc（酢酸カリウム）で満たされたときに私たちの電極抵抗が10 Mオーム程度である。 </li><li>シリンジとmicrofil針を使用して3 M KAc/30 mMのKClを含む溶液と電極の1組を記入してください。これらの電極は、電気生理学的に使用されます。 </li><li>染料の電極のバックエンドを浸漬することによりカルシウムインジケーター色素を有する電極の2番目のセットを埋める、以前に約で再構成。 500μg染料の40μlの蒸留水。電極の先端が満たされたとき、背中約1/4インチを埋める良好な電気的接触を確保するためのKCl 200mMのと電極の端の。 </li><li>これは色素注入を容易にし、複数の膜貫通による被害を減少させるので、それは、ベベル電極に有益である。我々は、塩水/アルミナ粉末懸濁液の流れを生成するカスタムbevelerを使用しています。電極をホルダに取り付けられ、その先端は45°の角度で流れに入ります。電極抵抗は連続的に監視し、面取りは抵抗のKAc充填電極の約5 Mohmをに達したときに終了します。染料埋め電極は同じ時間のために面取りされ、通常15から20 Mohmをの抵抗を持っています。 </li></ol> 3。カルシウム指示薬色素のロード<ol><li>電気生理学リグの準備を配置し、視覚的に興味のあるシナプス前ニューロンを見つけます。我々の実験の多くは、給餌、B21 5,6の間に利用同定感覚ニューロンで行われます。比較的固定positionは、大きさ（〜100μm）を、そしてB21のソーマの細長い形状は見つけることが容易になります。 </li><li>カルシウムインジケーター色素を含有する電極との利害のニューロンを突き刺す。 B21のIDはシナプス後ニューロンB8をimpalingによって確認することができます。 〜8 nAの電流でB21の脱分極は、スパイクとB8 7へのPSPのインストールを容易にする結果を引き起こします。 </li><li>約30分間過分極パルス（通常は-15 NA、1 Hzの、75％のデューティ·サイクル）を渡すことによって、興味のシナプス前ニューロンに色素を注入します。色素ローディングが成功した場合は、ニューロンの細胞体は、かすかなピンクの色を取得します。ゆっくりニューロンからそれを引き出すことによって色素含有電極を外します。 </li><li>染料はフォロワニューロンとシナプスを作る微細なプロセス中に拡散するまで、約30分のための準備を残す。 </li></ol> 4。カルシウムイメージングと電気生理学的記録<ol><li>イメージングmicroscに準備を置きOPE。準備と皿はぬれた粘土とは違って、粘り気のまま、Permagumシールコードの断片で冷却プラットフォーム上に保持されている。固定ステージ顕微鏡は、対物レンズを移動させることで焦点を当てています。ステージでは、磁石マウントマニピュレータを装着可能にする、静止したままである。高倍率は振動（特に横移動）が問題になり、全体のイメージングの設定が防振プラットフォーム上に配置する必要があります。 </li><li>通常の電解質溶液を含む電極を持つシナプス前とシナプス後ニューロンを突き刺す。 </li><li>画像カルシウムオレンジ（励起549 nmの発光576 nm）を8に適したフィルタブロックを選択して、カメラを調整します。最も科学的なCCDカメラは、調査員が読み出されるCCDセルのサブセットを選択することができます。さらに、細胞（ビニング）組み合わせることができます。ビニング増加感度ながら小さなサブセットを選択すると、速度が向上します。これらの2つの設定は、一緒に露光時間で、決定フレームレートは、1秒間に取得することができますどのように多くの画像、すなわち。適切な設定は、画像580×500×300ピクセル（10倍レンズと0.5倍のカメラアダプタを使用）と350μmの2の面積を務める。露光時間&lt;25 msの適正露出を提供する最小限の量に照度を調整する光路に中性濃度フィルタを追加します。 アメフラシに十分な速さで画像単一スパイク誘発カルシウム変化することである-これらの設定は、約30Hzのフレームレートをもたらすべきである。最後に、唯一の撮影領域が点灯しているように、視野絞りを閉じます。 </li><li>イメージングソフトウェアで、測定したいニューロンの領域をマークします。要素のARソフトでは、これは、興味のある領域（ROI）を置くことによって &quot;時間測定&quot;セクションで行われます。 B21は双極性ニューロンと前作でその横方向のプロセスに接触関心9のシナプス後ニューロンが実証されています。一般的に我々のイメージは、プライマリ、セカンダリ、および三次のブラジャーニューロンの各部分の上にROIを配置することにより、横方向のプロセスのnches。染料埋めニューロンの隣にある追加のROIは、後で他のすべてのデータポイントから差し引かれるバックグラウンド値を提供するために測定されます。 </li><li>カメラの &quot;フレーム読み出し&quot;信号によって提供されるトリガ信号を待つために電気生理学的買収を（これらの実験スパイクIIに）指示しています。画像取得（要素、AR）を起動して、カメラが最初のフレームを取るときにスパイクIIは自動的に録音を開始します。また、簡単に顕微鏡のカメラポートに搭載されたLEDをオンにするには1401電源のTTL出力を使用することができます。これはその後イメージングと電気生理学的なデータを同期させるための信号を提供します。 </li><li>所望の周波数で短い脱分極電流パルスのシリーズを注入することにより、シナプス前ニューロンを刺激する。活動電位はsuccessfあるかどうかを決定するために、各パルス（オシロスコープをトリガ刺激などによる）監視することが重要ですully生成。カルシウムオレンジは他の染料に比べて非常に安定した写真ですが、それは漂白染料がどのように発生するかを確認するためにはるかに刺激せずに、コントロールトライアルを記録することをお勧めします。 </li><li>細胞内カルシウム濃度が操作された実験では、このようなEGTAのような薬物は、シナプス前ニューロンに導入され、前述の刺激やデータ収集の手順が繰り返されます。 </li></ol> 5。代表的なデータの分析<ol><li>テキストフ​​ァイルに書き込むことによって、画像データ（各ROIの測定された強度値のリスト）をエクスポートします。スパイクIIでカスタムスクリプトは、テキストフ​​ァイルをインポートすることができます。このスクリプトは、個々のプローブの領域を使用して値を正規化し、バックグラウンドプローブの値を減算します。データポイントは、その後 &quot;仮想RealWave&quot;チャンネルとして電気生理学的データと一緒にプロットされます。スパイクIIにおける &quot;チャネルプロセス/タイムシフト機能&quot;は正確に撮像データポイを整列するために使用される参考として、LED信号を使用してNTS、。 </li><li>パーセントの変化に応じて値を取得するには、DF / F O = FF（O）/ F Oとしての蛍光の相対的な変化を計算することにより、画像データを分析します。 F Oは単なる刺激時の刺激とF蛍光の前に蛍光レベルを示します。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="図1" /> 図1実験の全体的なスキーム。実験は、 アメフラシの神経節の準備で行われます。細胞内カルシウムの変化は、イオン泳動シナプス前ニューロンに導入され、蛍光色素、で撮像する。そのシナプス伝達を誘導し、監視できるように、事前とシナプス後ニューロンはその後鋭い電極と突き刺されています。 <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="図2" /> <strオング&gt;図2カルシウムイメージングとアメフラシの頬神経節内の識別されたニューロンから細胞内記録。ニューロンB21の画像化された側枝の（）写真。ボックスには、関心の測定領域を示している。 B21の（B1）の細胞内刺激は、それはまた、活動電位を発生させる原因となって、シナプス後ニューロンフォロワーB8（真ん中のトレース）に活動電位（下のトレース）と容易性シナプス後電位（PSP）を彷彿とさせます。シナプス前カルシウム蛍光の増加は上のトレースに示されている。 homosynaptic円滑化に関するEGTAのシナプス前（B2）の効果。 EGTAは細胞内に注入したB21〜15分前に、細胞内刺激。それは、EGTAが低濃度でシナプス伝達を抑制するのに十分速くない遅効カルシウムキレート剤、であると考えられている。広範囲のカルシウム信号とPSP振幅の対応する減少の減少に注意してください。 （C）は、PSPの振幅は、シナプス前calciuと相関M信号。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

我々は、開示することは何もない。

我々は同時に、細胞内カルシウム濃度を監視し、シナプス伝達の有効性を評価するために用いることができるテクニックを紹介します。これらの技術は、短期可塑性の様々な形態が仲介されているどのように判断するのに役立ちます。 イメージングは​​蛍光顕微鏡とCCDカメラを用いて行われる。ほとんどの機能イメージングのセットアップと比較した場合、これらの?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>カルシウムオレンジ</td><td>インビトロジェン</td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマ</td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td>カルシウム校正バッファーキット</td><td>インビトロジェン</td><td> C-3008MP </td><td>信号の感度とダイナミックレンジをテストするのに便利</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>シグマ</td><td> M0250 </td><td>動物を麻酔する0.33 M溶液で使用</td></tr></tbody></table> 表1に使用する試薬。 <table border="1"><tbody><tr><td> 設備名 </td><td> 会社 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> FN-1直立蛍光顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>ナリシゲと、ITS-FN1ステージ</td></tr><tr><td> NMN-21マニピュレータ</td><td>ナリシゲ</td><td>磁石と一緒にステージに取り付けられた</td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCDカメラ</td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> NISの要素、AR （バージョン3.22） </td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>イメージングソフトウェアは、蛍光データを取得するために使用</td></tr><tr><td> 10X/0.3wプランフルーア客観</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>この水浸レンズは3.5mmの非常に長い作動距離を持つ</td></tr><tr><td> X-Citeの120 PCのメタルハライドランプ</td><td>エキスフォ</td><td>蛍光イメージングのために使用</td></tr><tr><td> LS-DWL ハロゲンランプ</td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3フィルターセット</td><td>クロマ·テクノロジー</td><td>; </td></tr><tr><td>パワー1401 A / Dコンバータ</td><td>ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン</td><td>サンプリングは3 kHzで行われていた</td></tr><tr><td>スパイクII （バージョン7.07） </td><td>ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン</td><td>電気生理学的データを取得するために使用されるソフトウェア</td></tr><tr><td> SEC-10 LXアンプ</td><td> NPIエレクトロニクス</td><td> 10Xヘッドステージで使用</td></tr><tr><td>モデル410アンプ</td><td>ブラウンリー精度</td><td>信号を増幅し、フィルタリングするために使用</td></tr><tr><td> WS-4 </td><td>マイナスKテクノロジー</td><td>イメージングのための防振</td></tr><tr><td>冷却プラットフォーム</td><td>カスタムメード</td><td>真鍮板に経由氷水を可変速度で励起される</td></tr></tbody></table> 表2機器に使用。

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

これは、細胞内カルシウムの変化はシナプス可塑性の重要な形態（例えば、homosynaptic促進）1の数の誘導を仲介することが示唆されている。これらの仮説は、同時に細胞内カルシウムの変化とシナプス伝達効率の変化を監視することによってテストすることができます。我々は、これは細胞内記録技術とカルシウムイメージングを組み合わせることによって達成することができる方法を示しています。我々の実験は、軟体動物アメフラシcalifornicaの頬神経節で行われている。この準備は、実験的に有利な多くの特長を備えています：Gangliaのは容易アメフラシから削除され、実験は通常のシナプス結合を作ると、通常のイオンチャネルの分布を持っている成人のニューロンを使用することができます。 アメフラシのために自然である動物の低代謝率と比較的低い温度（14-16℃）のために、準備が長時間安定しています。 ENT &quot;&gt;我々は簡単にイオントフォレーシスを介したニューロンに&quot;読み込まれる&quot;カルシウムオレンジ2の細胞透過性のバージョンを使用します。この長波長蛍光色素はカルシウムに結合すると、蛍光強度が増加し細胞内遊離カルシウムの変化を検出するためにはカルシウムオレンジありレシオメトリック色素（例えば、フラ2）とは異なり、高速の速度論的性質3とは、イメージングのためのフィルターホイールを必要としません。それは安定したかなりの写真や他の色素（例えば、フルオ3）2,4未満光毒性です。すべての非レシオメトリックと同様に染料、カルシウムオレンジはカルシウム濃度の相対的変化を示していますしかし、それはロードと拡散による色素濃度の変化を考慮することはできないので、それは絶対的なカルシウム濃度を提供するためにキャリブレーションすることはできません。 直立、固定ステージ、複式顕微鏡は、毎秒30フレームの周りの記録が可能なCCDカメラで画像ニューロンに使用されていました。 アメフラシこの時間分解能で細胞内カルシウム濃度であっても単一のスパイク誘発性の変化を検出するために十分です。シャープ電極を同時に同定前とシナプス後ニューロンにシナプス伝達を誘導し、記録するために使用されます。各試験の結論では、カスタムスクリプトは、電気生理学やイメージングのデータを結合します。適切な同期を確実にするために、我々は顕微鏡のカメラポートに搭載されたLEDからの光パルスを使用しています。シナプス前カルシウムレベル（細胞内EGTA注射を介してなど）の操作は、私たちは様々な形態の可塑性を媒介する細胞内カルシウムの役割に関する具体的な仮説をテストすることができます。

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

我々は、細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化が同時にのガングリオンの準備で監視する方法を示し<em&gt;アメフラシ</em&gt;。我々は、蛍光染料を使用して画像内カルシウム、カルシウムオレンジ、シャープ（細胞内）電極を用いたシナプス伝達を誘導し、監視します。

軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ<em&gt;アメフラシ</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

monitoring-changes-intracellular-calcium-concentration-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K ビュー.  Mt. Sinai School of Medicine. 我々は、細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化が同時にのガングリオンの準備で監視する方法を示しアメフラシ。我々は、蛍光染料を使用して画像内カルシウム、カルシウムオレンジ、シャープ（細胞内）電極を用いたシナプス伝達を誘導し、監視します。

ビデオ: Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

神経科学

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

カエルの神経筋終末へのカルシウム色素の神経切片への積載：カエル神経筋接合部におけるカルシウムの一時的な位置合わせ

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ

軟体動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ